剖析蛋白质组学在动物医学中发展
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蛋白质组学(proteomics)是以全面的蛋白质性质研究(如表达水平、转录后修饰、细胞内定位、相互作用等)为基础,在蛋白质整体水平上对疾病机理、细胞模式、功能联系等方面进行探索的科学,已被认为是理解细胞功能和疾病发生过程的核心[1-3]。自1994年Wilkins和Williams首次提出了蛋白质组(proteome)概念以来,蛋白质组学技术已成为后基因组时现疾病相关蛋白、寻找早期诊断标记和揭示致病机制的有力工具[4],并取得了一系列巨大的成就。近年来蛋白质组学已在人类疾病研究中得到广泛的应用,但在动物医学中的应用较为有限,目前主要集中在疫苗和药物开发领域[4-5]。本文就当前蛋白质组学在某些动物疾病研究中的应用及现状进行综述并分析其发展趋势,以期对利用蛋白质组学工具研究动物疾病的研究者有所启发。
1蛋白质组学常用研究技术
蛋白质组学技术主要包括基于二维电泳(two-dimensionelectrophoresis,2DE)、高效液相色谱(highperfoemanceliquidchromatography,HPLC)等蛋白质分离技术;与数据库搜索相结合的同位素标记定量质谱(isotope-codedaffinitytag)、荧光差异凝胶电泳(differenceingelelectrophoresis,DIGE)表面增强激光解吸/离子化飞行时间质谱(surfaceenhancedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry,SELDI-TOFMS)、电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)等蛋白质定量和鉴定技术[6]。近年来蛋白质组学技术在疾病研究方面表现出了独特的优越性并取得了显著的成绩。
2蛋白质组学在动物细菌性疾病研究中的应用
蛋白质组学在动物细菌性疾病中研究范围涉及细菌在不同环境下蛋白表达谱的变化、筛选疫苗候选蛋白以及鉴定与细菌的致病及耐药机制相关蛋白质蛋白质[7]。在完成羊种布鲁菌强毒株16M蛋白质组表达图谱的基础上,比较了牛源布鲁菌强毒株和疫苗株蛋白质组差异。结果表明,强弱毒菌株在铁代谢、糖结合、脂代谢及蛋白合成等方面有一定差异,从分子水平上解释了强弱毒菌株在代谢途径上的关键区别[8]。陈焕春等以2006年引起人发病死亡的2型猪链球菌(SS2)的四川分离株SC-21为研究对象,利用蛋白质组学技术研究了其在37℃(对照条件)和42℃(模拟发病猪的体温)培养条件下的分泌蛋白图谱的差异,并鉴定了5个差异蛋白,为揭示SS2的致病机理、筛选药物靶标以及新型疫苗的研究提供了部分依据[9]。刘国勇等[10]利用蛋白质组学技术分析柱状黄杆菌强毒株G4R3和弱毒株G18的胞外蛋白,共发现了34差异蛋白质点,鉴定出其中的7个蛋白点,分析后认为滑动蛋白K、腺酐甲硫氨酸合成酶和膜蛋白可能是柱状黄杆菌的毒力因子。TavernaF等[11]建立了奶牛炎病原金黄色葡萄球菌细胞表面可溶性蛋白2-DE参考图谱,为比较金黄色葡萄球菌不同菌株对奶牛的致病性和分析鉴定疫苗候选抗原奠定了重要基础。ZicbandtAK等[12]对两株不同的金黄色葡萄球菌RN6390和Col株研究发现发现葡萄糖激酶和脂肪酶蛋白质点存在于RN6390菌株中,而IgG结合蛋白、肠毒素、白细胞毒素D、肠毒素B等9种蛋白质点只存在于Col菌株中存在,为深入研究金黄色葡萄球菌的耐药机制和致病机制奠定了分子基础。
3蛋白质组学在动物病毒性疾病研究中的应用
蛋白质组学在动物病毒性疾病中的研究主要集中在病毒感染后诱导宿主细胞蛋白质组改变以及病毒感染的宿主血清/血浆差异蛋白质组研究等方面,如为揭示PK-15细胞感染CSFV后蛋白质组的变化,利用蛋白组学技术从感染48h的细胞中寻找并鉴定了35个差异表达蛋白质点。Westernblot分析证实了膜连蛋白2上调表达,甘油三磷酸脱氢酶(GAPDH)下调表达[13]。这些差异表达的蛋白是PK-15细胞对CSFV感染的特征性反应,有助于进一步研究CSFV的感染机理。进一步对感染CSFV猪血清进行了差异蛋白质组分析,鉴定了14种差异表达蛋白,其中的急性期蛋白接联珠蛋白(haptoglo-bin)、补体成分C4a、载脂蛋白A-1(apolipoproteinA-1)已被鉴定为其他疾病如乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染或相关癌症的潜在生物标记[14]。同样,鉴定的这些蛋白具也有作为CS-FV感染生物标记的潜能。DhingraV等[15]研究发现,野生型狂犬病病毒(Rabiesvirus,RV)感染能诱导与离子平衡有关的蛋白H+ATP酶和Na+/K+ATP酶上调表达,而Ca2+ATP酶下调表达,这些参与突触泡与突出前膜对接或融合的相关蛋白下调表达会导致细胞内Na+和Ca2+浓度降低和感染鼠的前联会积聚大量突出泡,而弱毒RV感染没有类似现象,这可能是野生型RV致神经机能障碍的机制。另外还发现,弱毒RV感染介导凋亡相关蛋白上调表达,而野生型RV没有这种现象,这一发现解释了仅有弱毒RV感染才能诱导细胞凋亡的分子机制。王娜[16]利用蛋白质组学技术分析了猪繁殖与呼吸综合征病毒071030株和福州株接种Marc-145细胞后蛋白质组学差异,为进一步研究PRRSV毒株间的致病力差异提供了分子基础。ZhangX等[17]用蛋白质组学相关技术发现在PCV-2感染PK15细胞后α微管蛋白、β肌动蛋白、及细胞角蛋白8发生了变化,为进一步理解PCV-2与宿主的相互作用奠定了基础。
4蛋白质组学在动物寄生虫病研究中的应用
蛋白质组学用于动物寄生虫病研究主要集中于对不同生活史阶段发育相关蛋白图谱以及发现药物靶蛋白和疫苗候选蛋白等方面。近年来,蛋白质组学在以血吸虫为代表的重大疾病研究中得到广泛应用。利用蛋白质组学技术,分离、鉴定出日本血吸虫天然分子质量31ku~32ku抗原组分,发现其中3个蛋白点与这些天然分子中起保护性的有效分子相关[18-19]。DvorkJ等[20]对日本血吸虫进行蛋白质组学分析,鉴定了361个蛋白质,其中15种为蛋白酶,并且组织蛋白酶B2能够消化宿主的表皮和结缔组织。YangLL等[21]利用蛋白质组学技术分离、鉴定日本血吸虫正常尾蚴及紫外线致弱尾蚴虫体间差异蛋白,分析得出20个差异表达蛋白,分别于细胞代谢、递呈、酶促反应等血吸虫生命活动相关。GardnerMJ等[22]应用蛋白质组学技术分别研究了恶性疟原虫在孢子期、裂殖体期、滋养体期和配子体期的蛋白质组变化。鉴别了恶性疟原虫1289种蛋白质,其中包括无性生殖期714种、配子体期931种和配子期645种。CohenAM等[23]以对数生长期刚地弓形虫为研究对象,用pH4~7和pH6~11分离到1000余种多肽,分离到3000~4000种多肽。
5蛋白质组学在动物其他疾病及相关领域研究中的应用
随着蛋白质组学技术的发展,该技术也在动物营养代谢疾病以及克隆动物研究领域中逐步得到应用。如EdvardssonU等[24]以高三酰甘油、高血糖和高胰岛素血症的小鼠作为临床肥胖症和胰岛素抵抗模型,给予PPAR-α特异性颉颃剂。结果表明,治疗后1周血浆三酰甘油、高血糖和高胰岛素水平明显降低,蛋白质组学分析发现至少有16个蛋白质位点表达上调,其中有14种为过氧化物酶体脂肪酸代谢有关的蛋白质。ChaeJI[25]等利用蛋白质组学技术分析了体细胞核移植技术克隆的成年猪胰脏蛋白质组的变化发现了69种差异蛋白质。在体细胞核移植样本中,与细胞调往相关的膜连蛋白,核纤层蛋白,热休克蛋白都发生了上调表达。而抗氧化蛋白和过氧化氢酶发生了下调表达。Westenblot鉴定结果显示抗氧化蛋白酶和抗凋亡蛋白也发生了下调表达,而凋亡蛋白酶却发生了上调表达。该结果提示克隆成年猪胰脏中活性氧自由基的积累导致了细胞凋亡的发生。
6展望
在疾病研究中,借助蛋白质组学工具可探究发现与疾病的发生、发展和转归过程密切相关的蛋白质及其变化特征,为揭示其疾病发生机制提供科学依据。从以上叙述可以看出尽管蛋白质组学在动物疫病研究中的应用主要集中在差异蛋白质的鉴定阶段且有关差异表达蛋白在病原体致病机制中发挥的具体作用尚未取得实质性突破,但事实证明用蛋白质组学方法寻找疾病相关蛋白是可行的。在寻找并鉴定差异蛋白质的基础上,结合其他技术分析并验证差异蛋白质的具体功能将是蛋白质组学用于动物医学研究的重点和难点,另外对致病过程定蛋白翻译后修饰模式的研究也是未来的研究方向。总之,随着蛋白质组学用于动物医学研究的不断深入,必将为相关疫苗、药物的研发及致病机理的阐明做出突出贡献。