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【摘要】核糖体核糖体S6Ks蛋白激酶是cAMP-cGMP依赖性激酶和PKC激酶超家族成员之一,在控制细胞大小、生长和繁殖中发挥着重要作用,通过协同作用方式达到组织器官的正常发展。核糖体核糖体S6Ks蛋白激酶的活化是一个复杂的过程。国外学者相关性的研究认为S6K蛋白激酶具有致癌潜能。研究S6Ks如何控制蛋白翻译和细胞生长等具体功能机制,将为攻克肿瘤疾病提供更为有效的药物治疗依据。
【关键词】核糖体核糖体S6Ks蛋白激酶;肿瘤
蛋白分子的磷酸化是细胞内信号传导过程中最重要的调节方式之一。各种蛋白激酶通过将ATP的γ磷酸基转移到底物特定的氨基酸残基上,使底物蛋白磷酸化,这种磷酸化作用不仅可以调节蛋白质活性,还可以使传导信号逐级放大,最终引起细胞内反应。可以这么说,细胞内所有的活动都离不开蛋白激酶的参与,而激酶的磷酸化作用也正体现了细胞信号传导过程中最为有效的调节方式。核糖体S6Ks蛋白激酶作为cAMP-cGMP依赖性激酶和PKC激酶超家族成员之一,在细胞生长、繁殖和细胞能量代谢过程中发挥着重要的作用。激酶的活性调节首先是通过一系列丝氨酸/苏氨酸位点的磷酸化和去磷酸化作用实现的,生长因子、细胞因子、激素等细胞外刺激信号可引起激酶的快速活化,而生长抑制物如类固醇等则能抑制激酶的活性。另一方面,活化的S6Ks蛋白激酶又可以将上游信号传导给多种效应底物,其中比较著名的就是核糖体蛋白S6,后者作为真核细胞中核糖体40S亚基的组成元件,通过增加具有5’末段寡嘧啶序列结构的mRNA的翻译,达到诱导多种蛋白组分合成的作用。
1核糖体蛋白S6Ks概述
S6Ks最初分离自有丝分裂剂刺激的瑞典鼠源3T3细胞系,经纯化、克隆、表达研究发现RPS6KB1基因定位在17号染色体长臂23位,由于选择性mRNA剪切和不同的翻译起始位点得到两个激酶同工型,分别命名为S6K1和S6K2。根据核浆定位的不同又将激酶区分为核定位的S6K1 I,S6K2 I和浆定位的S6K1 II,S6K2 II,两者的主要区别在于前者的氨基末端存在有额外的核定位信号。核浆表达转换是所有胞浆型S6K激酶具有的共同特点之一,表现为在血清饥饿的细胞中S6Ks II型主要存在于胞浆内,而当有血清或生长因子刺激时,S6K II型激酶将转入细胞核内,尽管这一改变的具体机制不甚明了,但其所存在的意义已经受到多方关注。研究表明S6Ks在控制细胞大小、生长和繁殖中发挥着重要作用,通过协同作用方式达到组织器官的正常发展。
2S6Ks分子的活化机制
首先,在我们具体研究S6K1磷酸化信号通路之前,我们有必要简述一下S6K1蛋白的一级结构组成,以及每个引起激酶活化的磷酸化位点及其之间的相互作用方式。 S6K1蛋白激酶主要由三个部分组成(图1),他们分别是:位于羧基末端的自主调控区,具有高度同源性的酸性氨基末端以及位于两者之间的丝氨酸/苏氨酸激酶催化区域(1)。
2.1S6K1多磷酸化位点到目前为止,在内源性S6K1蛋白激酶中已基本确定了八个主要的磷酸化位点(1)。其中位于激酶羧基末端自主抑制区内的Ser411、Ser418、Thr421和Ser424四个磷酸化位点是最先被确定下来的,被称作S/T-P位点,在有丝分裂原刺激的S6K1活化中发挥重要作用。这些位点具有的共同特点是在他们的+1位上有一脯氨酸而在-2位上有一疏水性氨基酸残基,这一结构可以被一系列脯氨酸作用激酶,例如Erk1和Erk2、压力活化蛋白激酶和Cdc2所识别,进而使位点得以磷酸化。随后研究又发现了拥有相同结构特点的Ser371位点和Thr229、Thr389、Ser404位点(2),其中Thr229位于激酶活化环中而其余三者位于连接催化区和自主抑制区的激酶铰链区,这些后期发现的位点均表现出对免疫抑制剂rapamycin和真菌代谢产物wortmannin的高度敏感,在激酶活化过程中具有重要作用。突变分析揭示Thr229、Thr389、Ser404位点有一共同特点即在它们的侧位上均有一些庞大的芳香族氨基酸,将这三个位点转变成酸性或者中性氨基酸会发现Thr229和Thr389具有重要调控作用,而Ser404仅表现一定调节功能。同源性分析还发现Thr229、Thr389、Ser371位点以及他们所定位区域在大部分Ser/Thr激酶的AGC超家族成员中高度保守,相反地,自主抑制区以及S6K1的羧基末端结构在AGC家族的其他成员中却显著缺失。这一不同使人们对自主抑制区在S6K1活化过程中的具体作用产生了疑问,为此多种S6K1蛋白截断体和不同位点突变体被相应构建出,用以分析在各种不同结构中,S6K1蛋白活性情况的改变。比较突出的发现是当截断S6K1的氨基末端时,将严重影响到激酶的活性以及有丝分裂原诱导的Thr229和Thr389位点的磷酸化,而这种影响在同时移除掉激酶羧基末端或缺失掉自主抑制区的情况下得以解救。这些结果说明自主抑制区或者说这些磷酸化位点定位的区域在调控S6K激酶活性以及Thr229和Thr389位点磷酸化的过程中起着重要作用。
【摘要】牙龈卟啉单胞菌是公认的牙周重要的致病菌,其分泌的牙龈蛋白酶R是其主要的毒力因子之一。蛋白酶激活受体是一种可识别多种分子的跨膜蛋白,牙龈蛋白酶R通过激活该受体在牙周炎的发生发展过程中发挥着重要的作用。本文就牙龈蛋白酶R和蛋白酶激活受体组成和生物学特性,牙龈蛋白酶R对蛋白酶激活受体的激活作用等研究进展作一综述。
【关键词】牙龈卟啉单胞菌;牙龈蛋白酶R;蛋白酶激活受体;牙周炎
【中图分类号】Q51
【文献标志码】A
牙龈卟啉单胞菌是牙周重要的致病菌之一,其分泌的牙龈蛋白酶包括牙龈蛋白酶R(gingipain R,rgp)和牙龈蛋白酶K(gingipain R,kgp),是牙龈卟啉单胞菌主要的毒力因子之一。蛋白酶激活受体(protease activated receptor,PAR)是一种可识别多种分子的跨膜蛋白,rgp通过激活PAR在牙周炎的发生发展过程中起重要的作用。
1 rgp和PAR的组成和生物学特性
1.1rgp的组成和生物学特性
牙龈蛋白酶又称牙龈卟啉单胞菌蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶或胰酶样蛋白酶,存在于牙龈卟啉单胞菌外膜、膜泡或细胞外。牙龈卟啉单胞菌至少85%的水解活性和100%的胰酶样活性是由其蛋白酶产生的,因而牙龈蛋白酶被认为是牙龈卟啉单胞菌的主要毒力因子,在牙体支持组织包括牙槽骨的破坏中起重要的作用,与牙周炎密切相关。牙龈蛋白酶根据其水解肽段是精氨酸特异性的或赖氨酸特异性的,分为rgp和kgp。rgp包括相对分子质量9.5×104的rgpA和相对分子质量5.0×104的rgpB两种形式,分别由rgpA和rgpB基因编码。rgpA又称为HRgpA。rgpB只含有一个催化结构域,而rgpA除此之外还具有一个血凝蛋白或黏附结构域,两者在催化结构域的DNA和蛋白质水平上都具有高度同源性。rgpA由于含血凝蛋白或黏附结构域,因此在一些活性上面有别于rgpB或起增强作用。
[摘要]多配体蛋白聚糖-4是一种新发现的多肽,广泛存在于多种组织中,调控着多种生物学效应。含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶(ADAMTS)-1是一种新型金属蛋白酶,广泛存在于哺乳动物和无脊椎动物体内,在保持凝血系统的稳态、器官生成、炎症和生育等方面起着重要的作用。二者均参与组织的创伤愈合过程,且ADAMTS-1特异性地作用于多配体蛋白聚糖-4,使其胞外区脱落。本文就多配体蛋白聚糖、ADAMTS-1、多配体蛋白聚糖-4与ADAMTS-1、多配体蛋白聚糖-4与牙周组织等研究进展作一综述,为探究牙周组织的损伤修复机制提供理论依据。
[关键词]Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶;多配体蛋白聚糖;损伤愈合;牙周组织
[中图分类号]Q 51[文献标志码]A[doi]10.3969/j.issn.1673-5749.2012.01.027
Role of syndecan -4 and a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif -1 in wound healingQin Yanyan, Wang Dan, Lin Chongtao.(Dept. of Periodontics, Hospital of Stomatology, Jilin University, Changchun 130021, China)
[Abstract]Syndecan-4, a newly discovered peptide, which distributes in many tissues, mediates a variety of physiological responses. A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif-1(ADAMTS-1), a novel metalloproteinase, is widely expressed in mammals and invertebrates cells. ADAMTS-1 plays a key role in physiology and pathology process such as maintaining coagulation system steady, organ formation, inflammation, reproduction. Many studies have shown that syndecan-4 and ADAMTS-1 are involved in the wound healing, and found that ADAMTS-1 is uniquely cleave the transmembrane proteoglycan syndecan-4. This review is about the structure, properties of the syndecan-4 and ADAMTS-1, and the role of them in wound healing. The purpose is to provide a theoretical basis for periodontal regeneration.
[Key words]a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif;syndecan;wound healing;periodontal tissue
组织的损伤愈合,伴随着基质的合成和降解。组织损伤之后,局部释放的大量的多配体蛋白聚糖,调控着细胞与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)、细胞与细胞间的信号交流,介导成纤维细胞的增殖和迁移,促进伤口愈合[1]。降解ECM的蛋白酶在组织的损伤愈合过程中也起着关键性的作用。迄今为止,多配体蛋白聚糖-4和Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif,ADAMTS)-1在创伤愈合过程中的作用备受关注。
1多配体蛋白聚糖
摘要】 目的 检测par1在鼻咽癌中的表达,探讨par1在鼻咽癌中表达的意义。方法 免疫组织化学(sp法)检测28例良性鼻咽组织、61例鼻咽癌组织中par1中的表达;采用rt?pcr、western blot检测鼻咽癌细胞系cne?1、cne?2中par1表达并比较其表达差异。结果 par1在鼻咽癌组织及两种鼻咽癌细胞株中均表达。par1在28例良性鼻咽组织表达为10例,61例鼻咽癌组织中表达48例。par1在鼻咽癌组织中的表达率明显高于在良性鼻咽组织中的表达率(p<0.01),高度恶性细胞株中par1的表达明显高于其低度恶性细胞株。结论 par1的表达与鼻咽癌的发生、生长方式、分期、恶性程度等有关。par1在鼻咽癌中的表达可能介导鼻咽癌侵袭转移等恶性生物学行为。 【关键词】 鼻咽癌 蛋白酶活化受体 转移
鼻咽癌是我国常见恶性肿瘤之一,极易发生侵袭转移,远处转移是其治疗失败的主要原因。目前认为,癌基因异常激活和抑癌基因监控失活在鼻咽癌侵袭转移等恶性生物学行为中起着重要作用,阐明上述机制,是控制鼻咽癌的关键。蛋白酶活化受体家族pars(protease-activated receptors)是介导血栓形成的一种g蛋白耦联受体,pars家族有4 种亚型,par1是其中研究最为深入的一种。par1表达于人多种正常细胞,在调节血栓形成、细胞粘附和迁移、整合素的衔接、有丝分裂、介导过敏等多种病理生理过程中发挥作用。新近研究发现par1在多种恶性肿瘤(如肺癌、乳腺癌、前列腺癌等)中也高表达par1,而且这种表达与肿瘤侵袭转移等生物学行为密切相关。par1在人鼻咽癌这一高度恶性高侵袭性的肿瘤中的表达未见文献报道。本实验首次对人鼻咽癌组织及细胞系中的par1表达进行研究,并探讨par1的表达在人鼻咽癌中的意义。
1 资料及方法
1.1 标本及临床病理资料
收集武汉协和医院耳鼻喉科门诊2006年12月~2007年9月期间的鼻咽部活检标本共89例,均为初治患者,所有标本均经光镜he染色后病理学诊断:其中鼻咽良性病变28例,鼻咽癌61例。肿瘤生长模式按照显微镜下npc 癌细胞生长方式分为三型[1]即: 癌细胞巢状膨胀性生长为主的regaud型,癌细胞弥漫性浸润性生长为主的schminke型,癌细胞既膨胀性又浸润性生长的combination混合型。
1.2 药物和试剂
细胞培养试剂购自gibco公司,trizol (invitrogen公司),逆转录试剂盒(k1621)由武汉晶美公司购自fermentas公司。par1鼠抗人单克隆抗体(购自santa cruz biotechology,sc?13503)。sp kit、hrp标记羊抗鼠igg购自、dab显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。蛋白裂解液购自pierce公司。
1.3 细胞培养
[摘要] 泛素-蛋白酶体通路(UPP)是细胞内重要的蛋白质降解系统。研究表明UPP参与恶性肿瘤多种细胞生物学过程的调节,影响其发生、发展。蛋白酶体抑制剂通过阻断UPP,可抑制肿瘤细胞生长,成为肿瘤治疗的新方法。肺癌在人类癌症死亡原因中居于首位,蛋白酶体抑制剂对肺癌的疗效研究仍在进行,其作用机制复杂,与NF-κB的下调、细胞周期调控、PTEN/PI3K/Akt通路和P53的调节等有关。本文对蛋白酶体抑制剂在肺癌治疗的新进展进行综述。
[关键词] 蛋白酶体抑制剂;泛素-蛋白酶体通路;肺癌;作用机制
[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2016)08(b)-0038-04
[Abstract] The ubiquitin-proteasome pathway is the principle pathway for intracellular protein degradation. Research shows that ubiquitin-proteasome pathway plays a significant role in the genesis and progression of malignancy by regulating many processes of cellular biology. Proteasome inhibitors targeting the ubiquitin-proteasome pathway can inhibit tumorous cellular growth, becoming a novel class of potent and effective antitumor agents. Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths globally. The study about the effect of proteasome inhibitors on lung cancer is ongoing. The mechanisms are complicated, relating to the down-regulation of NF-κB, cell cycle control, PTEN/PI3K/AKT pathway, the regulation of P53 and others. The recent advances about proteasome inhibitors in the treatment of lung cancer is going to be reviewed in this paper.
[Key words] Proteasome inhibitor; Ubiquitin-proteasome pathway; Lung cancer; Mechanism
泛素-蛋白酶体通路(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)是生物体内蛋白质降解的重要通路,此通路选择性降解细胞内受损及错误折叠的蛋白质,并对各种短寿命的功能蛋白具有快速降解作用。80%~90%的细胞内蛋白均通过此途径降解,其中包括细胞周期调控因子、基因转录因子、癌基因蛋白等[1]。UPP通过对上述蛋白的降解,调节细胞增殖、分化、存活和凋亡,在人体诸多生理过程中发挥重要作用,如信号转导、细胞周期调控、细胞凋亡调节、转录调控等,对维持细胞的稳态具有十分重要的意义,其功能的改变和异常能直接导致或诱发人类的许多重要疾病[2]。蛋白酶体抑制剂通过抑制蛋白酶体活性而阻断UPP,具有抑制多种肿瘤细胞增殖及诱导肿瘤细胞凋亡的作用,目前已成为抗肿瘤治疗的研究新热点。本文就UPP、蛋白酶体抑制剂在肺癌治疗中的进展综述如下:
1 泛素-蛋白酶体通路的组成
UPP由泛素、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3、26S蛋白酶体、去泛素化酶等组成。此途径的核心是26S蛋白酶体,它是一个多催化复合物,由20S核心蛋白酶和两端各一的19S调节亚基组成。20S核心蛋白酶是蛋白酶体复合物的水解核心,具有胰蛋白酶、糜蛋白酶和胱天蛋白酶活性。UPP在降解靶蛋白时,首先要实现靶蛋白的泛素化,即若干泛素经E1、E2、E3的作用与靶蛋白相连[3]。只有泛素化的靶蛋白方可被19S调节亚基识别,进而进入20S核心蛋白酶体内部,被降解成3~22个氨基酸的小肽段,在细胞内回收利用。泛素分子则被泛素解离酶从靶蛋白上解离下来,重复利用[4]。
【摘要】 目的 探讨类风湿关节炎(RA)患者20S蛋白酶体表达水平的变化及其与RA疾病活动性的关系。方法 测定RA患者及正常对照外周血单个核细胞20S蛋白酶体蛋白表达水平。结果 与正常对照相比, RA患者20S蛋白酶体表达升高[(2.92±1.41VS(0.65±0.42), P
【关键词】 类风湿关节炎;20S蛋白酶体;泛素-蛋白酶体途径;炎症
类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis ,RA)是一种以对称性、侵蚀性关节滑膜炎为特征的慢性、系统性自身免疫疾病, 炎症为RA发病机制的中心环节。泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway , UPP)是真核细胞内重要的非溶酶体蛋白降解途径, 20S蛋白酶体是UPP中具有蛋白酶催化活性的核心颗粒。UPP通过调控多种炎症调节蛋白, 在炎症过程中发挥着重要作用[1]。研究显示RA患者血清蛋白酶体及其自身抗体浓度升高, 蛋白酶体抑制剂可缓解关节炎大鼠病情进展[2], 提示蛋白酶体参与了RA的发生、发展。关节滑膜中炎症浸润细胞主要来源于外周血细胞[3], 循环单核细胞在RA发病机制中具重要作用[4,5]。RA患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)是否存在蛋白酶体表达及功能异常目前尚未见报道, 本课题通过检测RA患者20S蛋白酶体蛋白表达水平, 对该问题进行了初步探讨。
1 研究对象与方法
1. 1 研究对象 临床确诊的RA患者30例, 来自西安交通大学第一附属医院风湿科住院患者, RA诊断参照1987年美国风湿病协会分类诊断标准。健康对照28例, 来自西安交通大学第一附属医院体检中心健康体检人员, 排除自身免疫病性疾病。两组研究对象均排除心、脑、肝、肾疾病;急、慢性感染;恶性肿瘤等疾病。
1. 2 研究方法
1. 2. 1 一般临床资料 记录所有研究对象性别、年龄, RA患者记录病程, 检测类风湿因子、C-反应蛋白(C-reactive protein, CRP)、红细胞沉降率(ehythrocyte sedimention rate, ESR)、自身抗体, 计算发病时的疾病活动性评分DAS28。
1. 2. 2 PBMC的分离与纯化 取受试者空腹外周静脉血5 ml, 加肝素钠抗凝(3.8 μl/ml)。采用淋巴细胞分离液(上海华精)密度梯度法分离PBMC。
【摘要】 目的 探讨基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)在妊娠期高血压患者胎盘组织中的表达及其临床意义。方法 以2011年3月至2013年3月期间, 本院诊治的90例妊娠期高血压患者作为观察组, 选取同期40例正常妊娠产妇作为对照组, 通过免疫组织化学方法, 检测两组胎盘组织中MMP-9和TIMP-1的表达水平。结果 与对照组相比, 观察组MMP-9中阳性和强阳性率明显减少, P
【关键词】 基质金属蛋白酶-9;金属蛋白酶组织抑制因子-1;妊娠期高血压;胎盘组织
在我国, 妊娠期高血压的发病率约为10%, 患者多表现为高血压、蛋白尿等症状, 分娩结束后上述症状消失, 其病理基础为全身小动脉痉挛, 严重影响着母婴健康和安全。基质金属蛋白酶(martix metalloproteinnase, MMPs)及其抑制剂TIMP在胎盘组织中的表达水平与妊娠期高血压的发生、发展有着密切的关系[1]。本研究中, 通过妊娠期高血压患者与正常妊娠产妇胎盘组织中MMP-9和TIMP-1的表达水平比较, 探讨妊娠期高血压的发病机制, 现将结果报告如下。
1 资料与方法
1. 1 一般资料 2011年3月至2013年3月期间, 本院诊治的90例妊娠期高血压患者作为观察组, 选取同期40例正常妊娠产妇作为对照组。40例对照组中, 年龄24.0~42.0岁, 平均年龄(30.0±5.2)岁, 孕37.0~40.0周, 平均孕(38.0±1.5)周;90例观察组中, 年龄23.0~41.0岁, 平均年龄(30.5±5.5)岁, 孕37.0~39.5周, 平均孕(37.5±1.5)周。两组年龄、孕周比较, 差异没有统计学意义, P>0.05, 具有可比性。
1. 2 检测方法及判定标准[2] 胎盘娩出后, 取胎盘母面中央无钙化组织, 约1 cm3大小, 置于10%甲醛固定液中, 常规石蜡包埋、制片、切片。应用免疫组织化学方法, 根据试剂盒说明书, 进行MMP-9和TIMP-1表达的检测。在200倍光镜下, 对染色强度和阳性细胞分布进行评分:(1)0分:没有染色, 背景为均匀淡黄色;(2)1分:背景为浅棕黄色;(3)2分:背景为棕黄色;(4)3分:背景为深黄色或褐色。阴性:0~1分;弱阳性:2~3分;中阳性:4~5分;强阳性:>5分。
1. 3 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件进行分析和处理, 计数资料率的比较采用卡方检验, P
2 结果
【关键词】体外循环
【摘要】目的探索体外循环前后膜结合弹性蛋白酶(MBE)动力学变化,及MBE与术后炎性反应及组织功能之间可能存在的联系。方法连续收集10例体外循环下冠状动脉搭桥手术病人的资料,血样采集时间为开胸前、主动脉开放后、体外循环结束时、停机后3h和6h、术后第一天。分离血样中的中性粒细胞,使用底物分析法测定被分离的中性粒细胞的MBE。通过常规实验方法测定炎性反应和组织功能的生化标记物。结果开放主动脉后,MBE轻度升高,停机时达峰值,在术后第一天恢复到术前水平。与主动脉开放后中性粒细胞在肺内滞留相比,左房与右房血中的MBE没有差异。MBE或MBE总活性与术后炎性反应标记物如C反应蛋白(CRP)及组织功能标记物如乳酸、肌酸磷酸激酶(CPK)、丙氨酸氨基转移酶之间均无相关关系。结论体外循环促使中性粒细胞MBE表达,并在停机时达高峰,但与体外循环后炎性反应和组织功能的生化标记物之间没有特定关联,提示体外循环中还有其他重要机制参与了术后炎性反应和器官功能障碍的发生。
【关键词】体外循环;中性粒细胞膜结合弹性蛋白酶
EffectofCPBonmembrane-boundelastaseofneutrophils
【Abstract】ObjectiveTostudytheeffectofcardiopulmonarybypass(CPB)onthekineticchangeofmembrane-boundelastase(MBE)anditspossiblelinktothepostoperativeinflammationandorganfunction.MethodsTenconsecutivepatientsundergoneelectivecoronarybypasssurgerywithCPBwererecruitedinthestudy.Bloodsamplesweretakenbeforemediansternotomy,afteraorticdeclmping,attheendofCPB,3hand6hafterCPBandonthefirstpostoperativedayrespectively.MBEwasdeterminedbysubstrateassayfromisolatedneutrophils.Inflammationandorganfunctionmarkersweredeterminedwithroutinelaboratorymethods.ResultsMBEslightlyincreasedafteraorticdeclamping,reachedtoitspeakattheendofCPB,andreturnedtoitspreoperativelevelonthefirstpostoperativeday.Incontrasttolungsequestrationofneutrophilcount,therewerenotranspulmonarygradientofMBEbetweenleftandrightatriumafteraorticdeclamping.NeitherMBEnortotalMBEactivitywaspositivelycorrelatedwiththepostoperativeinflammationmarkerssuchasbloodlactateandC-reactiveproteinandorganfunctionmarkerssuchascreatinephosphokinaseandalanineaminotransferase.ConclusionCPBinducesMBEexpressiononneutrophilswithitspeakattheendofCPB.LackofassociationbetweenneutrophilMBEandclinicalmarkerssuggeststhatmultiplesystemsareinvolvedinthepost-CPBinflammatoryresponseandorgandysfunction.
【Keywords】cardiopulmonarybypass;membrane-boundelastaseofneutrophils
体外循环(CPB)能通过激活循环中细胞与体液成分,引起全身炎性反应综合征[1,2]。激活的中性粒细胞释放出的弹性蛋白酶,被认为是能够降解各种蛋白如弹性蛋白、纤维蛋白、糖蛋白等强有力的蛋白水解酶之一[3]。心内直视手术的病人在转流中和转流后,中性粒细胞均能释放弹性蛋白酶[4~7],但游离弹性蛋白酶能被体内广泛存在的蛋白水解酶抑制剂(proteaseinhibitor,PI)迅速结合而失去活性[8]。最近发现,中性粒细胞膜结合弹性蛋白酶(membraneboundelastase,MBE)能抵抗血浆和组织中蛋白水解酶抑制因子的作用[9],而且结合于中性粒细胞膜上的弹性蛋白酶,在攻击血管内皮细胞和引起组织损伤方面,较血浆中游离的弹性蛋白酶具有更强的生物活性[10~12]。本研究的目的就是研究心脏手术病人在转流中和转流后MBE的动力学变化,并试图寻找其与术后炎性反应及组织功能变化之间的关系。
1资料与方法
摘要:本研究以“豫谷1号”cDNA为模板,通过PCR技术获得类受体蛋白激酶基因SiRLK35(NCBI登录号:XM_0
>> 草菇丝/苏氨酸蛋白激酶同源基因的克隆及序列分析 丹参蛋白激酶SmSnRK2.4的克隆及表达分析 鳜鱼肌球蛋白重链基因的原核表达及多克隆抗体的制备 人类博卡病毒(HBoV)非结构蛋白NS1基因的克隆\原核表达及多克隆抗体的制备 花生蛋白激酶基因AhSTK的克隆与序列分析 滇龙胆GrHMA基因的克隆和原核表达 紫杉醇合成关键酶BAPT基因的克隆及原核表达 紫杉醇合成关键酶基因dbtnbt的克隆及原核表达 新疆红肉苹果PGIP基因的克隆及原核表达 雄激素受体、磷酸化蛋白激酶B在三阴性乳腺癌中的表达及意义 吉富罗非鱼mIgD基因恒定区序列的原核表达及多克隆抗体的制备 卵巢上皮性肿瘤中蛋白激酶B的表达及意义 人神经营养素-3基因克隆及原核表达 人参classIII几丁质酶Gchi1基因克隆及原核表达分析 左旋精氨酸对兔肺缺血―再灌注损伤时蛋白激酶C基因表达的影响 肠道病毒71VP1基因的克隆与原核表达载体构建 小麦自噬相关基因ATG4和ATG8的原核表达及蛋白纯化 Wee1蛋白激酶的研究及进展 Raf-1蛋白激酶及VEGF在大肠腺癌中的表达及临床意义 西尼罗河病毒E蛋白结构域Ⅲ基因的原核表达 常见问题解答 当前所在位置:l)网站分析其跨膜结构域。
1.5SiRLK35原核表达载体的构建
将经PCR扩增得到的SiRLK35基因回收纯化,与pMD18-T载体用T4 DNA连接酶于22℃连接5 min,转化大肠杆菌Trans 5α感受态细胞,均匀涂于100 mg/L Amp抗性LB平板,于37℃倒置过夜培养。对构建的中间表达载体,挑取单克隆经菌落PCR鉴定后,送至山东省农业科学院生物技术研究中心测序室测序。
使用BamHⅠ、SalⅠ分别酶切测序正确的pMD18-T-SiRLK35质粒及原核表达载体pET-28a,回收纯化酶切片段,用T4 DNA连接酶22℃连接5 min,转化大肠杆菌Trans 5α感受态细胞,酶切检测。选择鉴定正确的pET-28a-SiRLK35质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,均匀涂于100 mg/L Kan抗性LB平板37℃倒置过夜培养,挑取单克隆经菌落菌液PCR鉴定,获得阳性菌株。
用pET-28a质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,均匀涂于100 mg/L Kan抗性LB平板,于37℃倒置过夜培养,挑取单克隆经菌落PCR鉴定,获得阴性对照。
1.6SiRLK35融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE鉴定
分别将含有重组质粒pET-28a-SiRLK35的BL21(DE3)菌株及阴性对照菌株于37℃振荡培养,菌液按1∶50比例用液体LB培养基稀释,培养至OD600≈0.6,加入IPTG(终浓度为0.5 mmol/L)于25℃、200 r/min诱导12 h。收集菌液经超声波破碎后,5 000 r/min离心10 min,分别取破碎菌液、上清、沉淀进行12%SDS-PAGE电泳,经染色、脱色后观察并拍照。
摘要:水稻类受体激酶CRINKLY4参与了植物细胞的增殖和分化。为了寻找CRINKLY4的胞外结合蛋白,采用了水稻CRINKLY4的胞外域作为诱饵蛋白,酵母双杂交筛选两周的小苗cDNA文库。结果得到许多靶标蛋白,其中一个水通道蛋白质值得关注。
关键词:水稻;类受体激酶;酵母双杂交
中图分类号:Q291文献标识码:A文章编号:0439-8114(2011)14-2982-03
Study on Extracellular Binding Proteins of CRINKLY4 in Rice
YAO Qing-guo,LI Xiao-qin,ZHOU Er-peng,WANG Juan,FENG Jun-xia
(Chemistry Department of Shijiazhuang University,Shijiazhuang050035,Hebei,China)
Abstract: CRINKLY4 was a growth factor-like plant receptor kinase influencing a wide array of developmental processes including proliferation and differentiation. To search for extracellular binding proteins of CRINKLY4, the extracellular domain of CRINKLY4 was used as a bait in a yeast two-hybrid system to screen the cDNA library of leaves of two weeks old seedlings. Numerous candidate proteins including a notable intrusting protein were identified.
Key words: rice; receptor like kinase; yeast two-hybrid system