谷子类受体蛋白激酶基因SiRLK35的克隆及原核表达

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摘要：本研究以“豫谷1号”cDNA为模板，通过PCR技术获得类受体蛋白激酶基因SiRLK35（NCBI登录号：XM_0

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1.5SiRLK35原核表达载体的构建

将经PCR扩增得到的SiRLK35基因回收纯化，与pMD18-T载体用T4 DNA连接酶于22℃连接5 min，转化大肠杆菌Trans 5α感受态细胞，均匀涂于100 mg/L Amp抗性LB平板，于37℃倒置过夜培养。对构建的中间表达载体，挑取单克隆经菌落PCR鉴定后，送至山东省农业科学院生物技术研究中心测序室测序。

使用BamHⅠ、SalⅠ分别酶切测序正确的pMD18-T-SiRLK35质粒及原核表达载体pET-28a，回收纯化酶切片段，用T4 DNA连接酶22℃连接5 min，转化大肠杆菌Trans 5α感受态细胞，酶切检测。选择鉴定正确的pET-28a-SiRLK35质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，均匀涂于100 mg/L Kan抗性LB平板37℃倒置过夜培养，挑取单克隆经菌落菌液PCR鉴定，获得阳性菌株。

用pET-28a质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，均匀涂于100 mg/L Kan抗性LB平板，于37℃倒置过夜培养，挑取单克隆经菌落PCR鉴定，获得阴性对照。

1.6SiRLK35融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE鉴定

分别将含有重组质粒pET-28a-SiRLK35的BL21（DE3）菌株及阴性对照菌株于37℃振荡培养，菌液按1∶50比例用液体LB培养基稀释，培养至OD600≈0.6，加入IPTG（终浓度为0.5 mmol/L）于25℃、200 r/min诱导12 h。收集菌液经超声波破碎后，5 000 r/min离心10 min，分别取破碎菌液、上清、沉淀进行12%SDS-PAGE电泳，经染色、脱色后观察并拍照。

2结果与分析

2.1SiRLK35基因的克隆

2.2SiRLK35基因编码蛋白的生物信息学分析

通过ExPASy网站预测SiRLK35基因编码蛋白包含392个氨基酸残基，分子量为44.6 kD，等电点为6.88。使用SMART网站分析SiRLK35蛋白结构域，结果显示，在1～200氨基酸之间含有一个S_TKc保守结构域，为Ser/Thr蛋白激酶区，在311～386氨基酸之间有一个TFS2N结构域（图2）。通过SignalP4.1网站对其进行信号肽分析，结果显示，代表C值的线段在第30个氨基酸处分值较高，显示该处为信号肽剪切位点，1～28个氨基酸残基属信号肽，第29和第30个氨基酸残基之间为信号肽裂解点（图3）。使用TMPred网站分析显示SiRLK35蛋白有3个跨膜结构域。

使用BamHⅠ、SalⅠ双酶切pMD18-T-SiRLK35质粒，回收纯化SiRLK35片段，定向连入原核表达载体pET-28a中，转化大肠杆菌Trans 5α菌株，酶切验证，得到预期大小片段（图5）。转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株，进一步进行菌落PCR鉴定，筛选到阳性克隆，获得SiRLK35的原核表达载体pET-28a-SiRLK35 。

M：Trans2K Plus DNA Marker；1：酶切片段。

图5pET-28a-SiRLK35酶切验证

M：DL5000 DNA Marker；H2O：空白对照；-：阴性对照，空载体

pET-28a；+：阳性对照，质粒pET-28a-SiRLK35；1～7：阳性克隆。

图M：Blue Plus Ⅱ Protein Marker；1、2、3分别为含pET-28a-SiRLK35菌株诱导12 h后的上清、破碎菌液和沉淀；4、5、6分别为含pET-28a菌株诱导12 h后的上清、菌体上清混合物和沉淀。

图8SiRLK35融合蛋白诱导表达

3讨论与结论

谷子是起源于我国的传统作物，在我国北方地区种植广泛。谷子根系发达，蒸腾系数低，具有突出的抗旱性能[7]。近期，谷子基因组测序工作的完成为从分子水平揭示谷子抗旱机制奠定了基础[8]。

本课题组通过iTRAQ技术，以干旱处理的“豫谷1号”幼苗为材料，筛选到一个S-类受体蛋白激酶基因，命名为sirlk35，检索其序列并设计特异性引物，以谷子cDNA为模板，利用PCR技术成功克隆到基因全长。生物信息学分析显示，SiRLK35基因编码蛋白由392个氨基酸残基构成，等电点为6.88；结构分析显示，SiRLK35蛋白包含一个S_TKc保守结构域，为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶区，带有磷酸化位点，是信号级联反应中心[9]，此外还含有一个TFS2N结构域；信号肽分析显示，该蛋白N端有信号肽，推测属于分泌型蛋白；跨膜结构域分析显示，该蛋白含3个跨膜结构域，符合类受体蛋白激酶结构特征。

外源基因表达系统在生物学研究中应用普遍，其中大肠杆菌表达系统是蛋白表达技术中发展最早的一项[10]。尽管大肠杆菌表达系统无法进行翻译后加工（肽链折叠、氨基酸的修饰等），表达的蛋白多以无生物活性的包涵体形式存在，但其凭借培养方便、价格低廉、可大规模生产、遗传背景清楚、能够高水平表达外源基因、寄主菌株及载体较多以及安全性好等诸多优点[11]，依然是目前应用最普遍、最成熟的外源基因表达系统[12]。pET系统能阻止影响宿主细胞生长速度的毒性基因的克隆且能优化靶蛋白表达，广泛应用于大肠杆菌表达系统[13]，BL21（DE3）是pET系统最常用的表达宿主菌。IPTG是在诱导表达系统中最常使用的诱导剂，稳定且不被细菌代谢。大肠杆菌表达系统广泛应用在多个物种的基因外源表达中，杨书玲等[14]克隆了小麦TaPDK基因，通过大肠杆菌实现了表达并将蛋白纯化；宋杨等[15]克隆了短枝型苹果MdRGL基因，并通过pEGX-4T表达载体在大肠杆菌中实现了该基因的表达；赵丽等[16]在大肠杆菌中实现了水稻类受体蛋白激酶OsESG1的原核表达。

本研究利用pET系统构建了SiRLK35基因的原核表达载体pET-28a-SiRLK35，转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，经0.5 mmol/L IPTG于25℃、200 r/min诱导12 h，实现了SiRLK35基因在大肠杆菌中的表达，且诱导表达的蛋白在沉淀中含量较多，推测其主要以包涵体的形式存在，为进一步研究该基因功能以及抗体制备奠定了基础。下一步将在该工作的基础上，拟通过分离、纯化目的蛋白，进而制备蛋白特异性抗体，检测SiRLK35蛋白在植物中的表达情况，为进一步解析SiRLK35基因功能奠定基础。

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