纤维素酶产生菌的选育
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（吉林农业科技学院生物工程学院 ，吉林 吉林 132101）
摘要：从腐烂秸秆畜禽粪便土层分离得到一株产纤维素酶细菌，经初步鉴定为谷草芽孢杆菌，其产纤维素酶活力在培养42h后达到最大72.18U/ml，最佳pH为7.0。
关键词：腐烂秸秆；纤维素酶；细菌分离
中图分类号：S14 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-03-0070-1
0 前言
纤维素是世界上最为丰富而又可再生的一种多糖类物质，植物每年通过光合作用产生的纤维素类物质高达15.5×1010t[1]，纤维素酶在食品、饲料、纺织、造纸、制药、能源和环保方面有着重要应用价值[2]。纤维素在纤维素酶的作用下被分解成小分子可被利用的葡萄糖，用于食品、饲料生产，还能作为生产乙醇的原料，纤维素被分解后形成的L-乳酸，可用于生产可降解塑料，减少“白色污染”。目前很多研究说明很多真菌、细菌和放线菌都能产生纤维素酶。因此，分离筛选出高效生产纤维素酶的菌种具有重要的研究价值。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集 从腐烂秸秆的畜禽粪便土层（距离地表层10cm）采集样品，将样品装入无菌袋中，带回实验室备用
1.1.2 实验仪器 恒温干燥箱，高压蒸汽灭菌锅，超净台，紫外分光光度计，水浴锅。
1.1.3 培养基 富集培养基：叶粉或秸秆粉 5g/L，采样地土壤浸提液 100ml；增殖培养基：细菌培养基、大型真菌培养基、霉菌培养基均为常用普通培养基。筛选培养基：（1）纤维素筛选培养基（初筛）KH2PO4 2.0g/L，(NH4)2SO4 1.4g/L，MgSO4 7H2O 0.3g/L，CaCl2 0.3g/L，FeSO4 7H2O 5mg/L，MnSO4 1.6mg/L，ZnCl2 1.7mg/L，CoCl2 1.7mg/L，CMC-Na 2.0g/L；（2）玉米秸秆筛选培养基（复筛） KH2PO4 2.0g/L，(NH4)2SO4 1.4 g/L，MgSO4 7H2O 0.3g/L，CaCl2 0.3g/L，FeSO4•7H2O 5mg/L，MnSO4 1.6mg/L，ZnCl2 1.7mg/L，CoCl2 1.7mg/L，玉米秸秆6.0g/L。
1.2 方法
1.2.1 菌种分离 取的样品用上述土壤无菌水液在无菌环境下振荡30min，制得菌悬液。取10ml菌悬液，添加90ml相对应初始富集培养基，150r/min，37℃，培养14d。
1.2.2 菌种筛选 按菌体富集获得增殖菌液10ml，加入90ml纤维素筛选培养基中，在相对应的富集温度和转速下培养，培养最短时间为细菌7d，每隔2d取筛选后的菌液，作为以后筛选步骤的菌液。取5mL初步富集的菌悬液，分别接入到50mL的增殖培养基中，装入到150ml三角瓶，在对应的富集温度和转速下增殖培养。将菌液梯度稀释到10-7，每一个平板取0.5ml稀释液涂布固体增殖培养基平板，每梯度涂布 10个平板，倒置平板培养，温度和培养时间7d，挑取单菌落或纯菌丝于斜面上培养。
1.2.3 菌种初步鉴定 将筛选出的单菌株进行多次纯化培养后，进行鉴定，一部分用斜面培养基保藏于-4℃冰箱。采用革兰氏染色镜检和纯菌种菌落形态观察，对分离菌种进行初步鉴定。
1.2.4 纤维素酶活力测定 （1）标准曲线绘制；（2）粗酶液制取：将保藏的纯菌种活化后，接种于增殖培养，37℃，150r/min，振荡培养48h，按2%的接种量于30ml液体产酶培养基中，37℃，150r/min，振荡培养，定时取样测定发酵液中的酶活力；（3）DNS法测定酶活力：取发酵液于4℃，5000 r/min，离心10 min，得上清液。取4支带有20ml刻度的试管，每支试管加1ml酶液（其中1支对照，3支平行试验），样品管置于50℃水浴中，预热2min，对照管置于沸水浴10min，然后4支试管中加4ml已预热至50℃的1%羧甲基纤维素钠为底物溶液，样品管置于50℃水浴准确及时3min取出，流水迅速冷却，用蒸馏水定容20ml，摇匀后用分光光度计于485nm处测定吸光度值。1min生产1ug葡萄糖定义为一个酶活力单位。
2 结果与分析
2.1 分离筛选到菌株
通过对分离到的1株菌种的革兰氏染色和纯菌种菌落观察，暂时将其命名为J1。这个菌株经染色呈革兰氏阳性，着生鞭毛，椭圆到柱状，有芽孢生成，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。综上述特性与芽孢杆菌属的谷草芽孢杆菌特征很相似，暂归为芽孢杆菌。
2.2 酶活力测定结果
对J1菌株发酵温度和pH研究说明：纤维素酶活力随发酵时间的变化可以看出当发酵时间达到42h时，酶活力达到最大值；发酵液pH对酶活力也有影响(见图2)，其最佳pH值为7.0。
3 结论
通过从腐烂秸秆畜禽粪便土层分离得到的一个菌株，经初步鉴定为谷草芽孢杆菌同属菌种，对其生理生化特征研究，表明该菌株在42h产纤维素酶活力达到最大值72.214U/ml。我们分离得到的J1菌株产酶活力相对较高，应用产纤维素酶细菌来生产纤维素酶具有自身独特的优势，那就是菌种容易培养，增值速度快。虽然产纤维素酶活力并不具有明显优势，但可以通过菌种诱变技术或者基因工程技术来改良菌种，获得理想产纤维素酶的菌株。
参考文献
[1] 汪纬云,朱金华，吴守一.纤维素科学及纤维素的研究进展[J].江苏理工大学学报,1998,19(3):20-27.
[2] 曾傲,叶君.纤维素酶水解及其在能源与环境保护中的应用[J].广东化工,2006,162(33):25-28.
[3] 海斯尔哈吉木拉提.我国纤维素酶的开发及在食品工业中应用前景[J].科技信息,2008(9):102-103.
作者简介：梅玉峰，男，汉族，吉林榆树人，吉林农业科技学院生物工程学院生物工程专业本科生。