铅对细胞毒性的影响
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作者：吴小荣吕超李晓飞韩庆玲王杰易宗春单位：北京航空航天大学生物与医学工程学院
铅是常用的金属材料，过量摄入铅会引起造血系统的损害，从而引起的血红蛋白(Hb)下降、红细胞压积和/或红细胞渗透脆性降低，以及骨髓红系克隆形成单位CFU-E的形成能力降低等严重的红系方面的变化［2-3］。但是，关于铅离子造血毒性的机制目前尚有许多方面并不明确。K562细胞是Lazzio等在1975年建立的人类慢性髓系白血病细胞系，在一些诱导剂作用下可向红系和巨核系等方向分化，具有造血祖细胞的特点，是目前研究造血细胞增殖分化机制的常用模型。实验研究了铅离子在无明显细胞毒性的浓度范围内对K562细胞红系分化的影响，为进一步研究铅离子的红系血液毒性的细胞分子机制提供了一定的实验依据。
1材料与方法
1.1材料K562细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心;RPMI1640培养基(美国Invitrogen公司);胎牛血清(FBS，美国HyClone公司);醋酸铅(北京益利精细化学品公司);FITC-IgG和FITC-anti-humanCD71(美国Invitrogen公司)。
1.2方法
1.2.1细胞培养:K562细胞培养在体积分数为10%的FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基中于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养。
1.2.2胎盼蓝染色检测细胞活性:将对数生长期K562细胞以一定浓度接种于24孔板中培养12h后按照一定梯度加入不同浓度的铅离子在每一列孔中，每个浓度组4个平行。24、48和72h之后分别取出一定细胞，加入胎盼蓝染液染色5min，红血球记数板计数活细胞浓度，每个样取3次记数。计算出各浓度组相对于溶剂对照组的相对活力，相对活力(%)=100×各浓度组活细胞密度/溶剂对照组活细胞密度。
1.2.3联苯胺染色检测Hb合成:选用指数生长期的K562细胞，以1×105个/ml的细胞浓度接种于24孔培养板中，在37℃、5%的CO2培养箱中培养12h后，实验组分别加入终浓度为0、10、20和30μmol/L的铅离子，同时加入40μmol/L氯化高铁血红素(Hemin)，然后重新置于培养箱中避光培养。48h后收集细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，制备成细胞悬液，加入1/5体积的联苯胺－H2O2显色液(含质量体积分数为0.2%的联苯胺、0.5mmol/L冰乙酸，临用时加入50mmol/LH2O2)，显色10min，染色后细胞用红血球计数板在光学显微镜下计数500个细胞中Hb阳性(蓝染)细胞数，计算Hb阳性细胞比例。
1.2.4流式细胞术检测K562细胞表面转铁蛋白受体CD71蛋白的表达:将对数生长期K562细胞以2×105个/ml的浓度接种于24孔板中培养12h后，加入30μmol/L铅离子处理48h后离心收集细胞。用PBS-B(含1%BSA的PBS，4℃放置预冷)洗1次，再加入PBS-B重悬沉淀，然后加入FITC标记的CD71抗体5μl，混匀，避光4℃孵育30min;离心细胞，用PBS洗2次;上流式细胞仪进行检测。根据几何平均荧光强度计算出铅离子处理细胞的相对荧光强度(RFI)，RFI=金属离子处理样品几何荧光强度/对照样品几何荧光强度。
1.3统计学方法使用SPSS13.0进行分析，实验数据以x珋±s表示，P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1铅离子对K562细胞的生长抑制作用不同浓度的铅(醋酸铅，10～50μmol/L)离子处理K562细胞24、48和72h后，用胎盼蓝染色排除法检测细胞活性状况。结果发现，铅处理的细胞的活细胞数量出现浓度依赖的降低(图1A)，受处理细胞的死细胞比例与对照组相比并没有太大变化(均在5%以内)。显微镜下观察，细胞经铅处理后视野内细胞数量明显少于对照组细胞，形态没有明显变化(图1B和1C)。结果表明，铅离子对K562的细胞生长有较为明显的抑制作用，但无直接导致细胞死亡的细胞毒性。
2.2铅离子抑制Hemin诱导的K562细胞的Hb合成(红系分化)K562细胞用40μmol/LHemin诱导红系分化的同时加入不同浓度的铅离子，处理48h后收集细胞应用联苯胺染色法计数Hb阳性细胞分析铅离子处理K562细胞的红系分化情况。由表1可见，铅离子对Hemin诱导的K562细胞红系分化有较明显的浓度依赖抑制作用，铅离子各浓度组的红系分化抑制率分别为6.10%、8.91%和15.74%。
2.3K562细胞经铅离子处理后细胞表面CD71蛋白的表达变化应用免疫荧光标记抗体结合流式细胞术分析K562细胞经铅离子处理后细胞表面转铁蛋白受体(CD71)表达水平。结果发现，K562细胞表面CD71的表达水平在经30μmol/L铅离子处理48h后增加19.0%(图2)。
3讨论
首先观察了铅离子对K562细胞的毒性作用，结果发现铅离子在10～50μmol/L浓度范围内浓度依赖性的抑制细胞的活性;但是从细胞死亡率看，与对照组比较并没有明显的提高;而且，在显微镜下直接观察发现除细胞数量明显减少外，细胞形态与对照细胞比较也没有明显变化，没有表现出细胞死亡的形态特征。这提示在目前所用的浓度范围内，细胞数量的明显减少并非铅离子的直接细胞毒作用(细胞死亡)，而可能是抑制了细胞的增殖过程。Sarkar等的研究发现，醋酸铅能抑制K562和HeLa细胞的增殖，并且上调细胞血红素调节eIF-2α激酶(HRI)的表达和活性，因此，醋酸铅引起细胞增殖抑制可能是由于HRI的表达与活性上调而抑制蛋白质合成而引起的。
进一步观察醋酸铅处理K562细胞诱导红系分化的情况。结果显示铅离子浓度依赖性抑制K562细胞在Hemin诱导下向红系分化。人红系祖细胞(BFU-E)在暴露醋酸铅14d，表现出明显的红系造血抑制作用，其中1mmol/L可以完全抑制Hb合成。而有研究更是发现，BFU-E对铅(硝酸铅)的敏感性显著高于髓系CFU-GM，IC50分别是3.31μmol/L和63.58μmol/L。铅已经被公认可以通过抑制血红素合成过程中的ALAD和血红素合成酶的活性而抑制血红素合成。GATA-1是调节红系分化的特异性转录因子。有研究显示，铅可以取代GATA-1的锌指结构域中锌而影响其转录调节活性。这提示，铅可以通过调节红系特异性相关基因的转录活性而抑制红系分化。作为金属离子，铅可能会干扰铁离子转运过程，铁是合成血红素重要成份，因而也会影响血红素的合成。研究结果显示铅离子处理的细胞表面CD71表达有一定程度增加，提示由于非Fe金属离子的存在，可能会竞争性造成细胞内Fe水平降低，进而通过CD71基因非编码区的铁反应元件来调节CD71的表达。总之，实验观察到铅在没有表现出明显的直接细胞毒性的浓度下可抑制Hemin诱导的K562细胞红系分化，虽然血红素合成是造成红系造血重要机制，但并没有排除其他方面机制的存在，K562细胞可用于研究这种金属离子的红系造血抑制作用的相关机制。