HPLC法检测血清中伏立康唑含量的研究
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【摘要】 目的 建立人体血清样本中伏立康唑含量检测方法。方法 色谱柱为依利特C18柱(5μm,4.60mm×200mm);流动相为水:乙腈:冰醋酸:三乙胺=64:36:0.1:0.05;流速:1.2ml/min;检测波长:258nm。结果 伏立康唑在0.14~13.96μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系,r=0.998。结论 实验建立的hplc方法可以用于血清样本中的伏立康唑含量检测。
【关键词】 伏立康唑 血清样本 HPLC 含量测定
【Abstract】 Objective To establish a method to determinate the voriconazole content in human serum samples.Methods Eliter C18 column (200mm×4.6mm,5μm) was used with the mobile phase of water-acetonitrile-acetic acid-triethylamine (64:36:0.1:0.05).The flow rate was 1.2ml.min-1and the wave-length was 258nm. Results The calibration curve was linear in the range of 0.14-13.96μg/ml(r=0.998).Conclusion The established HPLC method can be used in the determination of voriconazole content in human serum.
【Key words】 voriconazole; serum sample;HPLC;determination
伏立康唑(voriconazole,VRC)是一个三唑类抗真菌药物,其作用机制是抑制真菌细胞色素p450依赖的14α-固醇脱甲基酶,而本品对于真菌细胞色素p450酶比对各种哺乳动物的细胞色素p450酶系统更具选择性。伏立康唑在0.03~64μg/ml的浓度范围内对几乎所有的实验真菌,包括致病性酵母菌和丝状菌属及双芽生菌的分离菌株均有作用。对一些条件致病真菌如曲霉菌属、隐球菌属及念珠菌属包括对氟康唑耐药的克柔念珠菌均有抗菌活性。本实验旨在建立血清样本中伏立康唑浓度检测方法。
1 实验材料
伏立康唑对照品,中检所提供。卡马西平对照品,中检所提供。乙腈:色谱纯,天津市科密欧化学试剂开发中心,批号:20051120。冰醋酸:分析纯,天津市化学试剂三厂,批号:20061228。三乙胺:分析纯,天津市东丽区天大化学试剂厂,批号:20040806。
Waters515高效液相泵,717自动进样器,996紫外检测器,Empower色谱工作站。
2 色谱条件及血浆样本处理方法[1~4]
2.1 色谱条件 色谱柱为依利特C18柱(5μm,4.60mm×200mm);流动相为水:乙腈:冰醋酸:三乙胺=64:36:0.1:0.05;流速:1.2ml/min;检测波长:258nm;柱温:室温。
2.2 标准液制备 精密称取伏立康唑对照品0.0340g,加甲醇溶解于50ml容量瓶中并稀释至刻度,即得698μg/ml的伏立康唑对照品溶液。精密称取卡马西平对照品0.0050g,用流动相溶于100ml容量瓶中并稀释至刻度,即得50μg/ml的内标溶液。
2.3 血浆样品的处理 取血浆0.2ml,内标10μl(卡马西平50μg/ml),混匀,再加入0.5ml甲醇,旋涡振荡0.5min,16000r/min离心5min; 吸取上清液100μl进样。3 方法学研究
3.1 专属性 在选定的色谱条件下,伏立康唑与内标卡马西平完全分离,且峰形良好,两者保留时间分别约为 8.4min和5.4min,空白血浆、空白血浆加药物及内标、含药血浆加内标按4法处理后,色谱图见图1。Ⅰ: 空白血浆;Ⅱ: 空白血浆加药;Ⅲ:含内标血浆;IV:2号受试者用药后2h色谱图
A:卡马西平, B:伏立康唑
图1 伏立康唑色谱图3.2 标准曲线及线性回归方程 用伏立康唑对照品溶液(698μg/ml)配制标准曲线工作液:将698μg/ml对照品溶液依次用流动相稀释,得到2.79、8.37、27.92、55.84、139.60、279.20μg/ml。
取空白血浆0.19ml分别置于系列试管中,分别加上述标准曲线溶液各10μl,配制成血浆浓度为样,按上0.14、0.42、1.40、2.79、6.98、13.96μg/ml的血浆标述4方法处理血浆样品,测定样品及内标的峰面积,计算其峰面积比值(伏立康唑/卡马西平,A),以峰面积比值A对血浆浓度C进行线性回归分析,求得线性回归方程为: C = 5.117 A +0.024 (w=1/cc),r=0.998。结果表明,伏立康唑血浆浓度在0.14~13.96μg/ml浓度范围内,线性关系良好,血浆样品可进行定量检测的最低浓度为0.14μg/ml。见图2。
图2 伏立康唑血浆标准曲线
3.3 绝对回收率 各取空白血浆0.19ml于15个空白试管中,5个为一组,分别加入8.37μg/ml(低浓度)、55.84μg/ml(中浓度)、139.60μg/ml(高浓度)伏立康唑对照品溶液10μl。得浓度为 0.42μg/ml、2.79μg/ml、6.98μg/ml的血浆样品。按上述4方法处理血浆样品,进样100μl,记录色谱峰面积。
另外,用纯水代替血浆重复以上步骤,记录色谱峰面积。以此为标准,将两组峰面积进行比较,计算伏立康唑的绝对回收率,结果见表1。
3.4 相对回收率试验 各取空白血浆0.19ml于15个空白试管中,5个为一组,分别加入8.37μg/ml、55.84μg/ml、139.60μg/ml伏立康唑对照品溶液10μl,得浓度为0.42μg/ml、2.79μg/ml、6.98μg/ml 的血浆样品。按上述4方法处理血浆样品,进样100μl,记录色谱峰面积的比值。将比值代入标准曲线,与理论值进行比较,计算伏立康唑的相对回收率,结果见表1。
3.5 精密度试验 取空白血浆0.19ml置于离心管中,分别加入已配制好的8.37μg/ml、55.84μg/ml、139.60μg/ml伏立康唑对照品溶液各10μl,按上述4血浆样品处理方法处理后,得血浆浓度为0.42μg/ml、2.79μg/ml、6.98μg/ml的血浆标样各15份,按上述4方法处理血浆样品,于同日和连续2日内各进样100μl,测定样品和内标的峰面积,计算其峰面积比值(A),并按回归方程求出对应浓度,以此计算其日内和日间变异,结果见表2。 表1 回收率试验表2 精密度试验
3.6 稳定性试验 取空白血浆0.19ml置于离心管中,分别加入已配制好的8.37μg/ml、55.84μg/ml、139.60μg/ml伏立康唑对照品溶液各10μl,得血浆浓度为0.42μg/ml、2.79μg/ml、6.98μg/ml的血浆标样各20份,分别于配制后立即、室温放置4h后,24h后反复冻融三次和1个月后,按上述4血浆样品处理方法处理,测定样品和内标的峰面积,计算其峰面积比值(A),并按回归方程求出对应浓度并比较测定浓度,以考察样品稳定性。结果见表3。
4 结果
测定血清样品中均匀加入低、中、高对照样品,以评价测定结果的准确性。配制方法:取空白血浆0.19ml置于离心管中分别加入已配制好的8.37μg/ml、55.84μg/ml、139.60μg/ml伏立康唑对照品溶液各10μl,得血浆浓度为0.42μg/ml、2.79 μg/ml、6.98μg/ml的血浆标样,按上述4血浆样品处理方法处理后,进样100μl,结果见表4。
5 结论
本实验建立起的HPLC检测伏立康唑血清样本含量的方法可行,检测的数据真实可靠,可以作为血清样本中伏立康唑含量测定方法。表3 样品稳定性试验表4 血清样品中伏立康唑检测结果
【参考文献】
1 国家药典委员会.中华人民共和国药典, 2005版.北京:化学工业出版社,2005,附录:28-30.
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3 G Srinubabu, Ch AI Raju, N Sarath,et al. Development and validation of a HPLC method forthe determination of voriconazole in pharmaceutical formulation using an experimental design. Talanta ,2007,(71):1424-1429.
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