大鼠脑出血后脑红蛋白在脑组织中的表达及其对细胞凋亡的影响

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇大鼠脑出血后脑红蛋白在脑组织中的表达及其对细胞凋亡的影响范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

[摘要]目的研究实验性大鼠脑出血后脑组织中脑红蛋白的表达及其对细胞凋亡的影响。方法随机将86只大鼠分为正常对照组、假手术组及脑出血组，应用立体定向技术，将自体未抗凝血注入大鼠基底节区制备脑出血模型。分别在造模后6、24、48、72小时断头取脑制作标本，采用TUNEL染色检测脑组织中细胞凋亡、荧光定量RT_PCR检测脑红蛋白mRNA表达、免疫组化分析脑红蛋白的表达。结果脑出血后6h血肿周围脑组织脑红蛋白及TUNEL染色阳性细胞表达升高，其中脑红蛋白48h达高峰，72h开始下降，而细胞凋亡72h达高峰，表达均明显高于假手术组和正常对照组，差异有统计学意义（P

[关键词]脑红蛋白；细胞凋亡；脑出血；大鼠

中图分类号：R743文献标识码：A文章编号：1009_816X（2014）05_0375_04

doi：10.3969/j.issn.1009_816x.2014.05.07Expression and Effects of ICH Rats Neuroglobin in the Brain Tissue and on Its Apoptosis. YAN Yong_xing， LIANG Li_zhen， YUAN Yan_rong， et al. Department of Neurology， The 3th Hospital of Hangzhou， Zhejiang 310009， China

[Abstract] Objective To study the expression of neuroglobin in brain tissue of rats with experimental intracerebral hemorrhage and its effect on apoptosis. Methods 86 rats were randomly divided into control group， sham _operated group and intracerebral hemorrhage group. Intracerebral hemorrhage was induced by stereotaxic injection of autologous blood into right caudate nucleus of the rats； Rats were killed at 6， 24， 48 and 72 hours after the establishment of animal models respectively. TUNEL method was used to detect apoptosis， while both RT_PCR and immuno_histochemistry were used to detect the expression of neuroglobin in brain tissues at different times after intracerebral hemorrhage. Results The expression of neuroglobin and TUNEL_positive cells in peri_hematomal brain tissue started to increase at 6 hours， the expression of neuroglobin peaked at 48h，and began to decrease at 72h.But， apoptosis peaked at 72h. which were all obviously higher than those in the sham_operated group and normal control group. neuroglobin expression was positively correlated with apoptosis cells. Conclusions The expression of neuroglobin in brain tissues was up_regulated after intracerebral hemorrhage， and it participated in the pathophysiologic course of intracerebral hemorrhage. It played an important protective effect against secondary neuronal injury.

[Key words] Neuroglobin； Apoptosis； Intracerebral hemorrhage； Rats

脑出血后继发性脑组织缺血坏死是导致患者神经功能缺损和死亡的重要原因，脑出血后继发性损伤既有多种损害机制，亦存在重要的神经元保护机制[1]。脑红蛋白（neuroglobin，Ngb）是神经元中重要的携氧蛋白，在神经元缺氧时能加速氧的运输，具有神经元保护作用[2]。本实验通过观察大鼠脑出血后脑内Ngb的表达，探讨其在脑出血后继发性脑损伤中的作用及与细胞凋亡的关系。

1资料与方法

1.1实验动物和分组：健康雄性SD大鼠86只，体重240～320g，由浙江中医药大学动物实验中心提供。随机分为3组：正常对照组（n=6），脑出血组（n=40）和假手术组（n=40）。脑出血组和假手术组动物在模型建立后6、24、48和72h 4个时间点各随机分为4个亚组，每个亚组包括10只大鼠。

1.2方法：

1.2.1脑出血动物模型的建立：参照文献[3]建立大鼠自体动脉血脑出血动物模型。大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3.0ml/kg），取尾动脉血50μl，应用脑立体定向技术注入大鼠脑内右侧尾状核。假手术组在右侧尾状核注入50μl生理盐水，其它条件与脑出血组完全一致。术中保持无菌操作，术后观察神经系统症状，在不同时间点处死动物。建模是否成功根据文献标准判定。

1.2.2标本的制备：各组大鼠分别在6、24、48和72h时间点给予10%水合氯醛深度麻醉，迅速打开胸腔，剪开右心耳，自左心室灌注生理盐水，致流出液清亮为止，再断头，迅速取脑。各亚组随机取5只大鼠脑组织迅速置于液氮保存（用于荧光定量RT_PCR检测Ngb mRNA），另5只大鼠脑组织置于中尔马林固定24h，沿针孔处作冠状切开，有明显血肿且无蛛网膜下腔出血，未破人脑室者为模型制作成功。沿针孔处冠状面前后各取厚约2.5mm的脑组织，做连续冠状切片，片厚5μm，分别作HE染色，TUNEL染色及Ngb免疫组化染色。

1.2.3TUNEL法检测脑组织中细胞凋亡：采用TUNEL试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）检测凋亡细胞。按试剂盒提供的步骤进行，苏木精轻度复染，镜下细胞核染色呈棕黄色为TUNEL阳性细胞，每只大鼠均取3张切片，在每张脑切片的脑出血部边缘随机选取5个高倍镜（400倍）不重叠视野，在图像分析仪下，计数阳性细胞数。

1.2.4RT_PCR检测Ngb mRNA：总RNA提取按照TaKaRa RNAiso Plus（Total RNA提取试剂）说明书进行。反转录按TaKaRa逆转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent要求，将已提取的总RNA反转录为cDNA，反转录反应条件：37℃ 15min，85℃ 5s。实时荧光定量PCR按照TaKaRa荧光定量试剂盒SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ进行，荧光定量PCR引物序列由生工生物工程（上海）有限公司设计并合成，各引物序列如下：Ngb：上游引物：5’_CTCCACAGCCTCTTCTGCTC_3’，下游引物：5’_ATTTGCTCTCGCTCATCTGC_3’。GAPDH：上游引物：5’_GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG_3’，下游引物：5’_ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA_3’。扩增反应条件如下：预变性：95℃ 3min；48个循环（95℃ 10s，60℃ 30s）；溶解曲线：从55℃开始，每30s升高0.5℃，直到95℃，循环一次。所有反应信息资料由Bio_Rad iQ5 PCR仪收集，Ct值通过计算机软件来测量和计算，转录水平通过公式2-CT计算。

1.2.5免疫组化染色检测Ngb表达相对含量：按兔鼠通用二步法免疫组化试剂盒（生工生物工程（上海）有限公司）步骤进行操作。常规脱蜡至水，3% H2O2溶液阻断过氧化物酶，10min；各步骤间以PBS冲洗5min×3次，滴加一抗，37℃孵育60min；PBS洗5min×3次；滴加二抗，37℃孵育60min；PBS洗5min×3次；DAB显色1～2min然后脱水、透明、封片。阴性对照用PBS代替一抗。

图像分析：选用荧光显微镜系统（Olympus BX_60型）及显微镜数码相机系统（Olympus DPIO型）进行图像采集。各切片选择4个不同的视野照相（放大200倍），各切片选择视野的位置保持一致。将照片输入计算机后，使用Image J图像分析软件进行分析。照片经过灰度转换和二值化处理后，由软件标记并计算出每张照片中阳性细胞的数量。

1.3统计学处理：采用SPSS10.0版统计软件，计量资料以（x-±s）表示，两样本均数比较采用t检验；多个均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；两变量之间采用直线相关分析，P

2结果

2.1血肿周围脑组织病理变化：正常对照组脑组织染色正常，细胞形态结构完整。假手术组仅在针道周围见少量散在的血细胞，72h时可见少量增生的胶质细胞。脑出血组6h时血肿周围脑组织病理改变与对照组相似，偶见散在炎性细胞浸润；24h时血肿中心区可见分散的神经细胞，血肿周围脑组织水肿明显，炎性细胞浸润明显，神经元散在，核固缩；48h时血肿周围脑组织损失最重，炎性细胞浸润明显，较多神经元核固缩、偏位；72h时血肿仍存在，部分血细胞溶解，含铁血黄素沉积，脑组织水肿仍存在，血肿周围脑组织稍好转，可见胶质细胞增生。

2.2TUNEL染色：正常对照组见少量TUNEL阳性细胞；假手术组各时间段均可检测到TUNEL阳性细胞；脑出血组6h后血肿周围脑组织可见TUNEL阳性细胞，72h达高峰，与正常对照组、假手术组比较差异有统计学意义（P

时间点TUNEL阳性细胞数（个）对照组假手术组脑出血组Ngb mRNA（荧光强度）对照组假手术组脑出血组Ngb蛋白（个）对照组假手术组脑出血组6h2.35±0.914.26±2.1452.65±9.30**0.55±0.210.93±0.311.50±0.32*11.07±2.1211.93±2.2417.35±2.89*24h5.47±1.8658.42±7.64**1.36±0.412.01±0.46*13.04±2.5321.03±2.65**48h4.75±2.4267.23±8.62**1.12±0.332.35±0.51**13.36±2.2625.33±3.67**72h6.74±1.9380.37±10.04**1.14±0.451.96±0.28*12.08±1.8720.24±2.61**注：与对照组及假手术组比较*P

2.4免疫组化检测：各组脑切片均可见Ngb免疫反应阳性细胞表达，脑出血组Ngb阳性细胞数量较正常对照组和假手术组明显增多，染色较强。图像分析结果显示，与正常对照组和假手术组比较，脑出血组Ngb表达显著升高，差异有统计学意义（P

2.5脑红蛋白表达与细胞凋亡的相关性分析：脑出血后血肿周围脑组织Ngb阳性细胞数与TUNEL阳性细胞数呈正相关（r=0.51，P

3讨论

随着人口老龄化及疾病谱的变化，脑出血的发病率及致残率日趋攀升，但现阶段对脑出血的治疗效果并不够理想，其原因主要是不能从病理生理学机制上控制疾病的发生和发展。脑出血后原发性损伤主要是占位效应所致，除此之外，血肿引起的继发性损伤亦起着重要作用。研究表明，脑出血后继发性损伤是导致患者病情加重及致死的主要因素[4]。探讨脑出血后继发性损伤的病理生理机制对于改善脑出血病情及预后是十分必要的，可为脑出血的治疗提供新的方向。

细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程，为一个渐进性过程。研究表明，细胞凋亡参与了脑出血后继发性损伤[1，4]。本实验发现，脑出血6h后血肿周围脑组织可见TUNEL阳性细胞，且72h达高峰，与正常对照组、假手术组比较有明显差异（P

大量研究表明脑出血后造成的继发性损伤除了存在如细胞凋亡、自由基损伤、氧化应激、血红蛋白毒性等多种损害机制外，但亦存在重要的神经元保护机制[1]。其中Ngb是继血红蛋白和肌红蛋白之后发现的第三类携氧球蛋白，它主要在脑内高表达，可特异性的为脑供氧[5]。邓美玉等[6]通过原位杂交发现，Ngb mRNA定位于神经元细胞质内，并广泛存在于大鼠脑内各个区域，认为Ngb在大鼠中枢神经系统功能活动中可能起重要作用。运用Northern杂交技术发现，Ngb在额叶、下丘脑和丘脑等处表达最强。Shang A等[7]的研究也表明在脑缺血缺氧损伤中，Ngb水平的变化可以反映脑组织的损伤程度。近年来研究表明，在脑出血后，Ngb表达增加，其在脑出血后继发性损伤中对神经元有重要保护作用[8]。本实验显示，脑出血后Ngb的表达水平升高，48h达高峰，72h开始下降，表达水平均明显高于假手术组和正常对照组，且Ngb阳性细胞数与TUNEL阳性细胞数呈正相关，既往研究也发现细胞凋亡促使Ngb的高表达，两者密切相关[9]，提示Ngb表达变化可能是脑组织对脑出血的一种内源性保护反应，Ngb促进氧向神经元中的线粒体扩散，有助于ATP的产生，从而对神经细胞功能的维持起重要作用[10]。

本实验研究发现，脑出血后Ngb表达上调，参与了脑出血的病理生理过程，可能对脑出血继发神经损伤起重要的保护作用。但其如何发挥保护生理机制尚不明确，这需要更深入研究Ngb的神经保护机制，探索是否有临床应用可能。

参考文献

[1]刘宝华，王小同.急性期脑出血神经损伤机制的研究进展[J].温州医学院学报，2012，42（5）：499-502.

[2]Raida Z， Hundahl CA， Nyengaard JR， et al. Neuroglobin over expressing mice： expression pattern and effect on brain ischemic infarct size[J]. PLoS One，2013，8（10）：e76565.

[3]李春岩，刘瑞春，胡书超，等.大鼠自体动脉血脑出血动物模型的建立[J].脑与神经疾病杂志，2003，11（6）：341-344.

[4]程娟，柯开富.脑出血后继发性脑损伤机制[J].国际脑血管病杂志，2010，18（10）：787-791.

[5]Hundahl CA， Kelsen J， Hay_Schmidt A.Neuroglobin and cytoglobin expression in the human brain[J]. Brain Struct Funct，2013，218（2）：603-609.

[6]邓美玉，张成岚，王航雁，等.脑红蛋白mRNA在大鼠脑内的定位[J].解剖学报，2003，34（1）：85-89.

[7]Shang A， Zhou D， Wang L， et al. Increased neuroglobin levels in the cerebral cortex and serum after ischemia_reperfusion insults[J]. Brain Res，2006，1078 （1）：219-226.

[8]Jin K， Mao X， Xie L， et al. Neuroglobin expression in human arteriovenous malformation and intracerebral hemorrhage[J]. Acta Neurochir Suppl，2011，111（12）：315-319.

[9]Guidolin D， Agnati LF， Tortorella C， et al. Neuroglobin as a regulator of mitochondrial_dependent apoptosis： a bioinformatics analysis[J]. Int J Mol Med，2014，33（1）：111-116.

[10]潘冬生，章翔，冯新莉，等.脑出血大鼠脑红蛋白表达与脑含水量变化[J].中华神经外科疾病研究杂志，2007，6（4）：349-351.

（收稿日期：2014_3_31）