高效液相色谱法测定大鼠海马中5-羟色胺含量的方法学研究

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作者：朱玲英，孔铭，彭蕴茹，王佩娟

【摘要】 目的建立了高效液相荧光色谱测定大鼠海马中5-羟色胺（5-ht）含量的检测方法。方法采用alltima c18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流动相为0.1 mol/l磷酸二氢钾溶液?甲醇(9∶1,v/v)，等度洗脱，流速1.0 ml/min。激发波长（λex）254 nm，发射波长（λem）338 nm。结果线性范围为0.70～8.40 ng(r=0.999 9)；当信噪比为3（s/n =3）时，检出限为1.27×10-3 ng；日内测得精密度相对标准偏差(rsd)为0.7%；重复性测定相对标准偏差(rsd)为2.8%；加样回收率为88.6%～101.5%。结论该方法简便、准确、灵敏，特异性强，重复性好，适用于海马中5-ht的含量测定。

【关键词】 5-羟色胺； 高效液相色谱； 荧光检测； 大鼠海马

abstract：objectivethe content of 5-ht in hippocampus of rat was determined by high performance liquid chromatograph-fluorescence (hplc-flu). methodsthe separation and determination were carried out by following conditions: alltima c18 column (250 mm× 4.6 mm,5 μm), 0.1mol·l-1 kh2po4 -methanol(9:1,v/v) as mobile phase , flow-rate was 1.0 ml·min-1. the fluorescence excitation and emission wavelengths were set at λ_(ex) 254 and λ_(em) 338 nm, respectively. resultsthe linear range of the method was 0.70 ～8.40 ng(r=0.999 9) for 5-ht .the detection limit of 5-ht was 1.27×10-3ng, when the ratio of signal to noise was 3. the inter -assay precision was 0.7%. the recovery was within the range of 88.6%～101.5%.conclusion the method is simple, sensitive, reliable and has strong specificity and good repetition .it is suitable for the content determination of 5-ht in hippocampus of rat, by high performance liquid chromatography.

key words： 5-hydroxy tryptamine (5-ht)； high performance liquid chromatography； fluorescence detection； hippocampus of rat

5-羟色胺（5-ht）是人体内一种重要的生物活性物质，参与脑缺血、镇痛、学习、记忆等多种生理过程，该物质广泛存在于脊椎动物脑内，在外周神经和其它组织中含量很低，对机体正常生理功能起着重要的调节作用［1～3］。因此定量测定5-ht含量对神经精神疾病、遗传性疾病、脑血管病以及发病机制的研究具有重要的价值。文献报道测定5-ht含量方法有比色法、荧光法、免疫法、高效液相-电化学色谱法（hplc-ecd）、高效液相-荧光色谱法（hplc-fld）［4］。本实验采用hplc-fld对大鼠脑匀浆样品液直接进行5-ht含量的测定，通过对色谱条件的优化，建立了稳定、快速、灵敏的含量测定方法并用于大鼠海马中该类物质的测定，为疾病的发病机理研究提供依据。

1 仪器和试剂

美国waters高效液相色谱仪（ 510泵， 474荧光检测器， 717自动进样器及柱温控箱等）；empower色谱数据工作站；瑞士mettler万分之一、十万分之一及百万分之一电子天平；美国milli-q纯水器；三洋mdf-382e超低温冰箱，beckman 21r高速冷冻离心机，上海金达生化仪器厂xuf-1高速分散器。

5-羟色胺（5-ht）标准品（1357359 33907213 美国fluka公司）；甲醇为江苏汉邦科技有限公司的色谱纯甲醇；其它试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 色谱条件色谱柱为alltima c18(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流动相为0.1 mol/l磷酸二氢钾溶液-甲醇（9∶1 v/v）；单泵等度洗脱；流速1.0 ml/min，；λex:254 nm；λem:338 nm；柱温：35℃。

2.2 标准品溶液的配制精密称取5-ht标准品适量，用0.1 mol/l盐酸制成0.35 mg/ml的对照品贮备液,避光冷藏保存。按实际检测需要，用0.1 mol/l盐酸溶液稀释到相应的溶度，供检测用。

2.3 大鼠海马脑组织匀浆样品的制备取大鼠海马组织，称湿重，以1∶10的比例加入0.4 mol/l的高氯酸，(即每100 mg脑组织加1 ml 0.4 mol/l的高氯酸)。冰浴下充分匀浆，冰浴沉淀30 min，于4℃，10 000 r·min-1离心15min，取上清液，每毫升上清液加0.75 ml 4%的碳酸氢钠溶液、混匀后，于4℃、3 000 r·min-1离心5 min，取上清液，过0.45 μm滤膜，分装，于-80℃保存待用。

3 结果

3.1 标准液和样品液的色谱分离图在选定的色谱条件下，标准品液与按“2.3”项下方法处理的样品分别进样的色谱图见图1～2，从图中可知，5-ht 峰形良好，无杂质峰干扰，其保留时间为9.9 min。

3.2 线性范围、检出限采用外标法，取0.7 μg·ml-1的5-ht标准液在选定的色谱条件下分别进样1，3，6，9，12 μl，以峰面积y为纵坐标、进样量x（ng）为横坐标作图，检测线性范围为0.70～8.40 ng（r=0.999 9）；峰面积与进样量呈良好的线性关系；以信噪比为 3（s/n =3）时，计算检出限为1.27×10-3 ng。

3.3 精密度、重复性实验在上述色谱条件下，取浓度为0.7 μg·ml-15-ht的标准液，重复测定5次，测得日内精密度相对标准偏差(rsd)为0.7%，表明实验方法精密度良好。

取同一样品平行5份，按“2.3”项下方法处理，在上述色谱条件下，连续进样5次，考察样品峰面积的重复性，结果相对标准偏差(rsd)为2.8%。表明实验方法具有很好的重复性。

3.4 回收率实验分别取浓度为0.175 μg·ml-1的5-ht标准品液6，8，10 μl；加入大鼠海马样品中，按“2.3”项下方法处理，重复测定6次。结果见表1。表1 5-ht的回收率测定结果（略）

3.5 样品测定结果用本法测定20份大鼠海马组织中5-ht含量为(0.41×10-3±0.18 )μmol/g，样品均能基线的分离，结果令人满意。

4 讨论

4.1 测定方法选择本文对5-ht含量检测比较了高效液相-电化学(hplc-ecd)和hplc-fld，发现应用hplc-ecd方法时,检测器对流动相的改变较敏感，使系统不易稳定。最终选择了高效液相分析中高分辨率，高灵敏度的荧光检测法。建立了适用于检测5-ht物质简单、快速、重复性好的hplc-fld。在探索该测定方法时，作者观察到海马组织样品的处理要快，制备好的待测样品要保存在-80℃冰箱内，这对得到良好的分析结果至关重要。

4.2 流动相条件优化流动相条件选择，比较了不同溶剂、ph值、浓度、比例、温度，经多次试验发现流动相中磷酸二氢钾的浓度在0.1 mol/l时与甲醇9∶1（v/v）配比后,在35℃流动相ph为4.6时,在此条件下的流动相等度洗脱，能使5-ht成分与杂峰基线分离且杂峰没有干扰，重复性好，由此确定为本实验分离条件。

【参考文献】

［1］林凌云，李 慧，许崇涛. hplc-荧光检测法测定大鼠脑组织中的单胺类神经递制质及相关物质［j］.华西药学杂志，2007，22（5）：557.

［2］张雷， 卢英俊， 邓同乐， 等. 高效液相色谱-荧光检测流速梯度法测定去卵巢小鼠脑内单胺类神经递质［j］.色谱，2005，1：76.

［3］石建， 缪丽燕. 高效液相荧光色谱法同时测定人体内5-羟色氨、5-羟吲哚乙酸［j］.苏州大学学报，2005,25(1):84.

［4］鲁燕侠，崔 佳，蔺兴谣，等.rp-hplc-荧光检测法测定小鼠脑组织中5 种神经递质的含量［j］.药学学报，2003，19（4）：262.