双抗夹心ELISA检测小鹅瘟病毒的研究

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摘要:采用双抗夹心elisa方法快速检测样品中的小鹅瘟病毒。结果表明，该方法特异性较好，灵敏度可达0.7412μg/mL。该方法可以用于鹅细小病毒(GPV)的临床诊断及样品中有效抗原组分的检测，结果准确、快速、重复性好，且EL1SA效价与AGP效价具有相关性。

关键词:小鹅瘟;双抗夹心;ELISA

中图分类号:S854.4+3文献标识码:A文章编号:1007-273X(2009)10-0021-02

小鹅瘟是由鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)引起，主要侵害1月龄以内雏鹅的一种急性、高度接触性、败血性传染病，传染性强、病程短且死亡率高[1]。一般根据该病的流行特点、临床症状和病理解剖可作初步诊断，但是当有并发症存在时，该病的特征病变并不明显，需进一步进行实验室诊断[2~4]。目前常用的诊断方法有琼脂扩散试验(AGP)[5，6]、免疫荧光试验(FA)[7]、对流免疫电泳试验(CIE)[8]、聚合酶链式反应(PCR)[9]和酶联免疫吸附试验(ELISA)[10]等。ELISA以其敏感特异、快速简便等优点得到越来越广泛的重视和应用。本试验通过制备辣根过氧化物酶标记抗体，建立双抗夹心ELISA方法，旨在为GPV的实验室诊断及定量检测提供切实可行的方案。

1材料和方法

1.1毒株、血清

GPV毒株由本所分离鉴定，GPMV、DHV、DPV毒株均由本研究室提供;鹅源GPV高免血清(AGP效价1∶128)、鹅阴性血清均由本研究室提供。

1.2主要试剂

酶标羊抗兔IgG、弗氏完全佐剂均购自Sigma公司，TMB购自华美生物公司，新生牛血清购自兰州民海生物工程有限公司，其他试剂均为分析纯。

1.3兔抗GPV免疫血清的制备

将GPV毒株经绒毛尿囊腔接种于12日龄易感鹅胚，收集48~60h死亡鹅胚尿囊液。按李茂祥等[11]的方法进行病毒纯化，经紫外吸收法测定病毒蛋白含量。将提纯的GPV病毒按比例与弗氏完全佐剂混合，皮下多点注射成年健康家兔，每隔10d后复免一次，直至AGP效价达1∶64后采集，与鹅阴性血清作用后保存备用。

1.4免疫球蛋白的提取

按周碧君等[3]的方法，采用硫酸铵盐析、凝胶过滤法和DEAE-离子交换纤维素法分别提取鹅源GPV高免血清和兔抗GPV免疫血清中的免疫球蛋白，经紫外吸收法测定其蛋白浓度。

1.5双抗夹心ELISA操作程序

①用CBS包被液将提纯的鹅抗GPV IgG包被于反应板，每孔100μL，4℃过夜后洗涤;②每孔加封闭液350μL，37℃作用2h后洗涤;③加入纯化的GPV抗原，每孔100μL，37℃作用1h后洗涤;④加入纯化的兔抗GPV IgG，每孔100μL，37℃作用1h后洗涤;⑤加入酶标羊抗兔IgG，每孔100μL，37℃作用1h后洗涤;⑥每孔加入底物溶液100μL，置暗盒内显色20min;⑦每孔加入50μL终止液，于450nm波长处测定各反应孔的OD值。

1.6最佳试验条件的确定

接常规程序进行下列条件筛选:鹅抗GPV IgG包被浓度(300，200，150，100，50，25μg/mL)、酶标抗体稀释倍数(1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000，

1∶6 000，1∶8 000，1∶10 000)、兔抗GPV IgG最适浓度(300，200，150，100，50，25μg/mL)。

1.7双抗夹心ELISA特异性测定

阻断试验:将GPV抗原分别与鹅抗GPV阳性血清、鹅阴性血清和兔抗GPV IgG及健康兔血清作用，4℃过夜，37℃孵育2h后，3 000r/min离心15min，取上清液检测，根据OD值变化判定其特异性;交叉试验:将GPV、GPMV、DHV、DPV及正常CEF培养液分别进行双抗夹心ELISA测定。

1.8双抗夹心ELISA敏感性测定及其与AGP的比较

将GPV毒株做10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6系列稀释，分别进行双抗夹心ELISA测定和AGP试验。

1.9双抗夹心ELISA重复性测定

用建立的双抗夹心ELISA检测纯化的GPV病毒，重复3次。

1.10双抗夹心ELISA方法的初步应用

利用建立的双抗夹心ELISA方法与AGP方法对135份疑似样品进行检测。

2结果

2.1最佳试验条件的确定

经方阵滴定法测定，鹅抗GPV IgG的最佳包被浓度为200μg/mL，兔抗GPV IgG的最适浓度为100μg/mL，酶标羊抗兔IgG的最佳稀释度为1∶4 000。

2.2特异性测定

双抗夹心ELISA方法检测GPV的特异性试验结果分别见表1和表2。

由表1可以看出，鹅抗GPV IgG、兔抗GPV IgG可以阻断GPV与酶标抗体间的反应，而鹅阴性血清和健康兔血清则不能阻断。

由表2可以看出，只有GPV毒株可以产生阳性反应，与GPMV、DPV、DHV和CEF培养液无交叉反应，具有较好的特异性。

2.3双抗夹心ELISA敏感性测定及其与AGP的比较

双抗夹心ELISA的最低检出量为0.7412μg/mL，AGP的最低检出量为74.12μg/mL，双抗夹心ELISA敏感性是AGP的100倍(见表3)。

2.4双抗夹心ELISA重复性测定

用建立的双抗夹心ELISA检测经纯化的GPV病毒，重复操作3次，检测结果的P/N值上下浮动不超过0.05，说明建立的双抗夹心ELISA方法具有很好的重复性。

2.5临床样本的病毒检测

利用建立的双抗夹心ELISA及AGP检测采自江苏、安徽、山东、浙江等地的样本145份，其中AGP方法检测有69份为阳性，ELISA方法检测86份阳性，其检出率分别为47.6%和59.3%，双抗夹心ELISA方法比AGP方法检出率更高。

3讨论

(1)目前用于小鹅瘟的实验室诊断方法虽然有很多，但大都存在一定的缺陷。如病毒中和试验(VN)方法准确可靠，重复性好，敏感性高，易于操作，但较费时，不适于大批量检测;琼脂扩散试验(AGP)方法简单，但不能用于微量检测，敏感性低，很难在临床上推广应用;免疫荧光试验(FA)检出率高、特异性强，但需配备荧光显微镜，且方法比较繁琐，不易普及;聚合酶链式反应(PCR)能在几小时内即可得到准确结果，对极其微量的GPV也能检出。但通常PCR都要用多次传代分离的病毒进行诊断，在传代的过程中样品容易被呼肠孤病毒、腺病毒等污染，污染后分离出的病毒通常是污染病毒而不是小鹅瘟病毒;而酶联免疫吸附试验(ELISA)是常见的检测小鹅瘟的有效方法，具有较高的特异性和敏感性，可用于GPV的定性和定量分析，适用于大批量样品快速检测，便于在基层单位推广应用。

(2)本试验通过制备纯度较高的GPV病毒免疫家兔，获得了效价高、特异性强的兔抗GPV血清。将不同抗体与GPV抗原结合使用，形成了“鹅抗GPV抗体――GPV抗原――兔抗GPV抗体――酶标羊抗兔抗体”的双夹心结构，克服了单株抗体捕获抗原能力弱的缺点，加强了抗原抗体反应的特异性，减少了假阳性结果。同时，经反应条件的筛选，排除了因抗体浓度不适而造成的不确定因素，进而确定了反应的最佳条件，并进行了特异性和重复性试验，获得了较为满意的结果。

(3)通过本试验对临床病例的检测结果可以看出，虽然近年来随着疫苗的广泛应用，小鹅瘟的大规模暴发流行己受到明显控制，但由于疫苗质量、使用方法、免疫程序等问题，该病依然广泛存在。而本方法适用于小鹅瘟病毒的定性与定量分析，可供小鹅瘟的疫情监测、疗效检查和流行病学的调查等。

参考文献:

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[2]王永坤，郑玉美.小鹅瘟病毒特性及防治的研究[J].中国农业科学，1982(1):10-18.

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[4]郭兴福. 小鹅瘟的实验室诊断技术[J].畜牧兽医科技信息，2005(8):69.

[5]佘永建，胡世君，黄伟，等.利用琼脂免疫扩散试验检测小鹅瘟病毒抗原及抗体的研究[J].中国畜禽传染病，1995(5):202-204.

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[11]李茂祥，李俊宝，郑玉美.小鹅瘟病毒纯化及其理化特性的研究[J].病毒学报，1990，6(2):155-159.