清肺利气通络法中药对哮喘模型大鼠肺组织白介素17表达的影响
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摘要：目的探清肺利气通络法中药对卵清蛋白（OVA）致敏哮喘大鼠肺组织白介素17（IL-17）表达的影响。方法40只雄性SD鼠随机分为空白组、模型组、布地奈德组和清肺利气通络颗粒组，每组10 只。空白组不给予任何处理，其余3组动物均以OVA致敏和激发方案建立哮喘模型。模型组仅造模，不给予任何其他药物处理；布地奈德组在每次雾化激发前1h给予布地奈德混悬液雾化吸入15min；清肺利气通络组在每次雾化激发前分别给予清肺利气通络颗粒灌胃。末次激发4 h后处死大鼠，取肺组织进行病理切片，HE染色观察肺组织病理形态及免疫组化检测IL-17的表达。结果HE染色镜下显示：与模型组比较，布地奈德组和清肺利气通络颗粒组的肺组织病理形态均有减轻。模型组、布地奈德组和清肺利气通络组大鼠肺组织中IL-17平均光密度（OD）值均较空白组显著增高（P
中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1007-2349（2017）06-0018-05
【Abstract】Objective： To study the effect of Qingfei Liqi Tongluo （QLT） method on the expression of interleukin-17 in lung tissue of asthmatic rats induced by ovalbumin （OVA）. Methods： 40 male SD rats were randomly divided into a blank group， a model group， a budesonide group and a QLT granule group， 10 rats per group. The blank group was not treated with any drug and the other three groups of the rats were induced by OVA to sensitization and stimulation to establish asthma models. The model group was only modeled with no other drug. The budesonide group was given inhalation of budesonide suspension for 15 min at 1 hour after each atomization. The QLT group was administrated with QLT granule before each atomization. The rats were sacrificed 4 hours later at the last stimulation， and their lung tissue was taken for pathological sections. The pathological changes of lung tissue were observed by HE staining and the expression of IL-17 was detected by immunohistochemistry. Results： Compared with the model group， the histopathological changes of the lung tissue in the budesonide group and QLT granule group decreased under HE staining. The mean optical density （OD） of IL-17 in the model group， budesonide group and QLT group were significantly higher than those in blank group （P
【Key words】bronchial asthma， Qingfei Qi Tongluo， interleukin 17， traditional Chinese medicine
哮喘，即支气管哮喘，是一种以慢性气道炎症和气道高反应性为特征的异质性疾病，临床上以反复发作的喘息、咳嗽、气促、胸闷为主要表现[1-2]。儿童哮喘的发病率逐年增高，且易反复发作。临床治疗需要长期规范吸入糖皮质激素和支气管扩张剂以及口服白三烯受体拮抗剂等，严重者甚至需要使用全身激素，影响儿童的身体和心理健康，也给家庭和社会带来沉重负担[3-4]。
哮喘的发病机制极为复杂，尚有许多机制仍不是很清楚。目前国内外研究表明：哮喘动物实验及临床患者的血清、肺泡灌洗液、痰液和肺组织中白介素17（IL-17）均可有不同程度的升高，提示IL-17在哮喘的发病中起到重要作用[5-8]。中医药治疗哮喘取得了较多新的进展，笔者长期应用清肺利气通络法治疗儿童哮喘，取得了满意的疗效。为了进一步探讨其作用机制，建立卵清蛋白（OVA）致敏哮喘大鼠模型，评价以清肺利气通络法组方的清肺利气通络颗粒对哮喘大鼠肺组织IL-17表达的影响。
1材料
1.1实验动物SPF级健康6周龄雄性SD大鼠40只，体重180～220 g，购自军事医学科学院实验动物中心，合格证号SCXK（军）-2009-003，饲养于天津市南开医院实验动物中心。
1.2药物实验用清肺利气通络颗粒由炙麻黄、杏仁、生石膏、生甘草、浙贝母、地龙、紫苏子和葶苈子组成，采用北京康仁堂药业有限公司生产的中药免煎配方颗粒配置而成，实验前配置成浓度为2 g（生药）/ml的蒸馏水混悬液；吸入用布地奈德混悬液（澳大利亚AstiaZeneca Pty Ltd.批号319722）。
1.3试剂材料卵清蛋白（OVA）（美国Sigma公司，批号A5503），氢氧化铝Al（OH）3（分析纯）（天津致远化学试剂有限公司，批号2016072092），水合氯醛（上海化学试剂公司，批号 20140825），0.9%生理盐水（天津百特医疗用品有限公司，批号C1608017）兔抗大鼠IL-17抗体（美国AbSci公司，批号 6909），SP免疫组化染色试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司，批号 999098）及增强型HRP-DAB底物显色试剂盒（北京天根生化科技有限公司，批号 P4617）。
1.4仪器403E型空气压缩式雾化机（江苏鱼跃医疗设备有限公司），CX31 型光学生物显微镜（日本Olympus公司），BW3200S型电子天平及BL-220H型电子天平（上海精密仪器仪表有限公司），ASP200S全自动组织脱水机（德国Leica公司），EG1150C独立冷台-分体式石蜡包埋机（德国Leica 公司），RM2235切片机（德国Leica公司）。
2方法
2.1分组将40只SPF大鼠按照随机数字表分为4组：空白组、模型组、布地奈德组和清肺利气通络颗粒组，每组均为10只。空白组不给予任何处理，其余3组动物均按照文献方法[9]，以OVA致敏和激发方案建立哮喘模型：造模实验的第0、7、14 d给予40 mg OVA+2 mg AI（OH）3+1 mL生理盐水混悬液腹腔注射致敏；第21～27 d，分别将实验动物置于1自制长方体密闭玻璃箱内，给予OVA和0.9%生理盐水配置成的1% OVA 雾化激发建立哮喘模型，每日雾化1次，每次30 min。模型组仅造模，不给予任何其他药物处理；布地奈德组在每次雾化激发前1 h给予布地奈德混悬液雾化吸入15 min；清肺利气通络颗粒组在每次雾化激发前分别给予清肺利气通络混悬液2 mL灌胃。末次激发4 h后取材。
2.2取材方法以5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，固定，开胸取新鲜双肺组织，将左肺置于10%福尔马林溶液固定，常规方法石蜡包埋、切片，分别行苏木精-伊红（HE）染色及免疫组织化学检测。
2.3肺组织HE染色大鼠肺组织于10%福尔马林溶液固定24 h后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制备厚度4 μm的切片，贴片，恒温箱烘干，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精复水，每个样本随机选取5张切片，然后苏木素染色、酸水及氨水分色，冲洗、梯度酒精脱水，入酒精伊红染色，纯酒精脱水，二甲苯透明，最后中性树胶封片。
2.4免疫M化法检测大鼠肺组织中IL-17的表达常规固定，脱水，透明，石蜡包埋，切片，贴片，每个样本随机选取5张切片，脱蜡、复水。3% H2O2 20 min抗原修复，PBS清洗5 min×3，山羊血清封闭30 min，加一抗（以1：100 稀释的兔抗大鼠IL-17），以PBS代替一抗作为阴性对照，4℃冰箱保持过夜，PBS清洗5 min×3，加二抗（生物素标记的抗兔IgG）于37℃恒温孵育30 min，PBS清洗5 min×3，加DAB显色液显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，最后中性树胶封片。每张切片随机选取5个视野进行图像采集，并利用Image-Pro Plus 6.0图像分析测定其光密度值（OD）进行比较。
2.5统计学方法所有计量资料均采用SPSS17.0统计学软件进行统计，运用KolmogorovCSmirnov test分析均属于正态分布。采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）比较，组间两两比较采用Dunnett’s t-test。P
3结果
3.1各组大鼠一般表现空白组大鼠无异常表现；模型组动物在接受OVA雾化吸入后开始表现为竖毛、烦躁、抓耳挠鼻、呼吸急促，后表现为精神倦怠、蜷缩、腹肌抽搐、甚至有大小便失禁等；布地奈德组和清肺利气通络颗粒组上述表现程度均较模型组减轻。
3.2各组大鼠肺组织病理形态学改变光镜下观察肺组织HE染色病理片。空白组大鼠各级支气管无明显炎症细胞浸润，结构正常。模型组大鼠支气管壁周围有大量炎性细胞浸润，皱襞增多，部分肺泡腔增大、破裂、融合。布地奈德组和清肺利气通络颗粒组大鼠肺组织病理形态改变均较模型组减轻。见图1。
3.3各组大鼠肺组织IL-17免疫组化比较模型组、布地奈德组和清肺利气通络颗粒组大鼠肺组织中IL-17平均OD值均较空白组显著增高（P=0.000，0.000，0.000均
4讨论
我国儿童哮喘已呈逐年上升趋势，对患儿身心健康以及家庭社会产生严重影响[3，4，10]。而哮喘的发病机制极为复杂，尚不完全明确，目前公认与免疫、神经内分泌因素和遗传学背景等密切相关。最新的研究表明，除了Th1/Th2失衡在哮喘的发病中起到重要作用，Th17细胞分泌的IL-17在哮喘的发病过程中同样起到了关键作用[11-12]。IL-17能够通过某些炎症因子或趋化因子介导而募集活化的炎症细胞于气道内聚集，进而导致哮喘相关的病理因素增加，进而诱发或加重哮喘[8，11]。实验研究表明模型组大鼠肺组织IL-17表达显著高于空白组，与文献报道结果一致。
根据全球哮喘防治创议（GINA）及我国儿童支气管哮喘诊断与防治指南，哮喘的治疗主要依赖于吸入糖皮质激素（ICS），如布地奈德、氟替卡松等，并根据阶梯方案适当选择白三烯受体拮抗剂或/和β2受体激动剂，严重者需要使用全身激素等[3]。有报道哮喘儿童ICS治疗易引起口腔菌群失调，治疗的前1～2年可能减缓生长速度，且家长对于长期吸入激素的心理压力，往往造成治疗依从性下降，导致哮喘反复发作[3，13]。
中医学认为哮喘的发作，是由于内有伏痰，感受外邪而诱发。所谓外邪侵入肺经，肺失宣肃，肺气闭阻，引动伏痰，痰凝气道，气机升降不利，而致喘息、呼吸困难、喉间痰鸣，发为哮喘[14]。笔者认为肺络是由肺经分出后，又逐层分级，形成由别络至孙络的布散于肺组织的各级分支组成的一个系统的网络系统。肺络在解剖形态上与类似于现代医学的气管支气管，在功能上包括了现代医学意义上的气管支气管以及神经、内分泌及免疫系统的功能[15]。因此，哮喘发作实质是外邪引动伏痰，肺络闭阻，气机不利而致喘息、痰鸣等证候。在哮喘治疗上，运用清肺利气通络法组方的清肺利气通络颗粒治疗儿童哮喘取得了满意的临床疗效。其组成主要为炙麻黄、杏仁、生石膏、生甘草、浙贝母、地龙、紫苏子和葶苈子。方中麻黄辛温，开肺平喘，解表散邪，有宣肺利气通络之功；杏仁利气平喘，并与麻黄相使，助麻黄平喘；生石膏味甘、辛，性寒，与麻黄、杏仁合用，寓麻杏甘石汤之意而宣肺泄热，清肺利气平喘。此外，方中葶苈子归肺、膀胱经，有泻肺涤痰、利气平喘之功；紫苏子利气定喘，止嗽消痰；地龙味咸性寒，长于清热平肝、熄风止痉、平喘、利尿、通络除痹，本方之中取其清肺热、通肺络、平气喘之用，更可增麻黄宣通肺络之功；浙贝母苦寒，归肺、心经，具有清热化痰、利气止咳、消痰散结之功，全方合用具有较好的清肺利气、通络平喘的功效。
本研究表明，清肺利气通络颗粒可以通过减轻哮喘大鼠肺组织IL-17的表达，改善肺组织病理形态，与布地奈德干预组比较，无明显的差异，具有较好的效果，提示清肺利气通络法中药治疗支气管哮喘具有很好的优势，值得进一步深入研究。
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