非小细胞肺癌中ING1基因的突变分析

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【摘要】 目的 探讨生长抑制（inhibitor of growth1,ing1）基因是否在非小细胞肺癌 (non?small cell lung cancer,nsclc)中存在突变，以确定该基因在nsclc发病过程中的作用。方法 选择突变率较高的ing1外显子2，应用聚合酶链反应?单链构象多态性分析（polymerase chain reaction ?single strand conformation polymorphism,pcr?sscp）检测73例nsclc和13例非癌肺组织中ing1的突变情况。结果 未发现所扩增的片段有泳动速率的改变，没有发现额外迁移带。结论 在nsclc中ing1基因突变很少见，ing1表达产物降低可能发生于转录或转录后水平。 【关键词】 肺肿瘤 ing1基因 突变 pcr?sscp

肺癌是我国高发的恶性肿瘤，该肿瘤的发生常与抑癌基因的突变和(或)表达改变有关，ing1基因是garkavtsev等[1]成功克隆出的一个新的抑癌基因，它定位于13q33?34，体外实验表明ing1基因可抑制细胞生长和诱导细胞凋亡，并与p53有相互协同和依赖作用，在细胞周期调节中起负调控作用[2,3]。在头颈肿瘤[4]和乳腺癌[5]中ing1存在不同程度突变及表达异常。ing1基因的研究在肺癌中少见报道，为了确定ing1在nsclc发病过程中可能的作用，我们对ing1在nsclc中的突变情况进行了初步研究。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集nsclc标本73例，包括湖北省肿瘤医院和东风汽车公司总医院1999年10月～ 2003年11月病理存档蜡块共61例；湖北省人民医院2004年11月～ 2005年6月肺癌手术切除新鲜标本12例。经病理确诊，腺癌35例，鳞癌38例；高分化癌25例，中分化癌19例，低分化癌29例；病理分期按1997 年国际抗癌联盟（uicc）的标准，ⅰ+ⅱ期41例，ⅲ期32例。13例非癌肺组织（癌旁肺组织7例，肺炎性假瘤6例）为湖北省人民医院2004年11月～ 2005年6月手术切除新鲜标本。新鲜标本在-80℃冰箱保存备用。全部标本均经病理证实，术前均未经放疗、化疗。

1.2 实验试剂 dna抽提试剂蛋白酶k（merk分装）、十二烷基硫酸钠、rnase a均为上海生工产品。pcr引物、taq况dna聚合酶、dntp、10×buffer均由上海生物工程公司提供；丙烯酰胺、n，n?甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺均为amersco公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 组织dna提取 参照文献[6]石蜡组织经二甲苯脱蜡、酒精水化后和新鲜标本都用标准酚氯仿法抽提dna，用紫外分光光度计测od260值定量。

1.3.2 pcr扩增 我们选取ing1基因外显子2区域扩增，4对引物序列见表1。pcr反应体系总体积25μl，以基因组dna为模板；94℃预变性5min；94℃变性30s、62℃退火30s、72℃延伸1min，共32个循环后72℃延伸5min。扩增完毕后,所得pcr产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定。表1 pcr引物序列

1.3.3 sscp分析 取3μl pcr产物，加碱变性液，37℃孵育10min后加变性上样缓冲液；300v电泳5min后，5v/cm置冰箱(4℃)电泳至溴酚蓝到达底部。电泳结束后，取下凝胶，行银染。与非癌肺组织相比，以等位泳动条带位置异常或多出泳动条带判断基因外显子突变。

2 结果

2.1 pcr扩增 ing1第2外显子4对引物所对应的条带均扩增成功。产物大小与预期一致，结果见图1。

2.2 sscp结果 对用4对引物扩增73例nsclc和13例非癌肺组织的dna产物，经变性凝胶电泳和银染，所有肿瘤组织和非癌肺组织表现为两条（两条均为单链）迁移带，未发现任何nsclc和非癌肺组织之间存在泳动速率的改变，表明ing1外显子2在nsclc和非癌肺组织之间无序列上的差异,见图2。

3 讨论

haga等[7]研究发现nsclc中13号染色体是易发生杂和性丢失的区域，表明位于该区域内的抑癌基因可能通过突变来影响蛋白构像而参与肿瘤的发生,这是值得探讨的问题。本研究对73例nsclc进行了pcr?sscp分析，却未检测出ing1外显子2存在突变；肺癌中ing1基因突变可能不是ing1丧失抑癌功能的主要因素。tallen等[8]用此方法在脑肿瘤中也未发现ing1基因的突变；toyama等[5]在检测的377例乳腺癌中仅有1例ing1发生错义突变；而gunduz等[4]研究发现，在34名头颈肿瘤中有6例外显子2有突变，其中3例为错义突变，突变率为13%；提示ing1基因突变在不同组织来源的肿瘤中存在差异。对ing1基因结构进行突变分析时，我们设计了4对引物来扩增ing1的外显子2,主要是因ing1外显子2是四种ing1剪接产物的共有部分，此序列参与mrna的转录调控[9]。ing1基因外显子2存在突变，可能影响所有ing1剪接产物的结构，并影响phd锌指序列的功能[10]。本实验虽然未能检测到外显子2的突变，但也不能排除其他外显子发生突变的可能。

已知抑癌基因在肿瘤发生过程中通过表达下调、碱基突变、甲基化、杂合性或纯合性缺失等多种形式失活。本研究的结果基本排除ing1在nsclc发生过程中通过突变而丧失抑癌功能的可能。本研究组以往研究结果[11]显示ing1基因通过低表达参与nsclc的发生、发展。我们推测该基因的低表达可能发生在转录或转录后水平。因此有必要通过对其在转录或转录后水平进行进一步研究，全面揭示该基因在nsclc发病过程中所起的作用。另外ing1基因的甲基化、杂合性或纯合性缺失等都有可能使ing1基因产物表达下降或缺失，ing1基因的甲基化、杂合性或纯合性缺失等也需要进一步研究。

总之，ing1作为抑癌基因，除了表达下调，其主要失活方式不是突变，可能有多方面的原因，如甲基化、等位基因缺失或转录水平异常导致ing1基因表达的丧失和（或）蛋白功能的异常，导致ing1基因产物相应抑癌功能减弱等，从而影响nsclc的发生、发展，这些还有待进一步探讨。

【参考文献】

［1］ garkavtsev i,kazarov a,gudkov a,et al.suppression of the novel growth inhibitor p33/ing1 promotes neoplastic transformation[j].nat genetics,1996，14(4):415?420.

［2］ garkavtsev i，riabowol k.extension of the replicative life span of human doploid fibroblast by inhibition of the p33ing1 candidate tumor suppressor[j].mol cell biol,1997，17(4):2014?2019.

［3］ helbing cc,veillette c,riabowol k,et al.a novel candidate tumor suppressor,ing1,is involved in the regulation of apoptosis[j].cancer res,1997，57(7):1255?1258.

［4］ gunduz m,ouchida m,fukushima k,et al.genomic structure of the human ing1 gene and tumor?specific mutations detected in head and neck squamous cell carcinomas[j].cancer res,2000，60(12):3143?3146.

［5］ toyama t,iwae h,waston p,et al.suppression of ing1 expression in sporadic breast cancer[j].oncogene,1999，18(37):5187?5193.

［6］ 戴小波,黄志勇,孟凡青.改良石蜡切片dna 提取法在检测人瘤病毒中的应用[j].临床与实验病理学杂志,1998，14 (4):405.

［7］ haga y,hiroshima k,iyoda a,et al.frequency of loss of heterozygosity at 3p,9p,13q,and 17p is related to proliferative activity in smokers with stage i non?small cell lung cancer[j].thorac cardiovasc surg,2005，53(2): 114?117.