离体大鼠肠道菌对6种皂苷类成分代谢研究
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[摘要] 为考察离体大鼠肠道菌群对6种皂苷类成分代谢转化的情况，将6种皂苷类成分单体（三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rg2，人参皂苷Re，人参皂苷Rd和人参皂苷Rb1）分别与离体大鼠肠道菌群在厌氧条件下孵育8，24 h，通过乙腈沉淀蛋白和乙酸乙酯萃取处理后，采用LCQTOFMS/MS对代谢产物进行定性分析。通过比较空白对照样品和加药孵育样品的总离子流以及各个色谱峰的准分子离子和多级碎片离子，分析各皂苷类成分在大鼠粪便中可能的代谢产物。结果发现，大鼠肠道菌群对6种皂苷类成分具有显著的代谢转化作用，三七皂苷R1主要被代谢为5个产物，代谢途径为三七皂苷R1人参皂苷Rg1人参皂苷Rh1和人参皂苷F1原人参三醇脱氢原人参三醇；人参皂苷Rg1主要被代谢为4个产物，代谢途径为人参皂苷Rg1人参皂苷Rh1和人参皂苷F1原人参三醇脱氢原人参三醇；人参皂苷Rg2主要被代谢为2个产物，代谢途径为人参皂苷Rg2原人参三醇脱氢原人参三醇；人参皂苷Re主要被代谢为4个产物，代谢途径为人参皂苷Re人参皂苷Rg2人参皂苷F1原人参三醇脱氢原人参三醇；人参皂苷Rd主要被代谢为4个产物，代谢途径为人参皂苷Rd人参皂苷Rg3和人参皂苷F2人参皂苷Rh2原人参二醇；人参皂苷Rb1主要被代谢为5个产物，分别为人参皂苷Rb1人参皂苷Rd人参皂苷Rg3和人参皂苷F2人参皂苷Rh2原人参二醇。综上所述，6种皂苷类单体均能够被离体大鼠肠道菌群代谢，主要的代谢途径为脱糖基和脱氢。
[关键词] 大鼠肠道菌群； 皂苷类成分； LCQTOFMS/MS； 代谢； 脱糖基
Metabolism of six saponins by rat intestinal bacteria in vitro
GAO Xia1，2， GENG Ting1，2， MA Yang1，2， LI Yanjing1，2， HUANG Wenzhe1，2， WANG Zhenzhong1，2， XIAO Wei1，2*
（1Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.， Ltd.， Lianyungang 222001， China；
2State Key Laboratory of Pharmaceutical Newtech for Chinese Medicine， Lianyungang 222001， China）
[Abstract] To investigate the metabolism of six saponins by rat intestinal bacteria in vitroSix saponins， including notoginsenoside R1， ginsenoside Rg1， ginsenoside Rg2， ginsenoside Re， ginsenoside Rd and ginsenoside Rb1， were incubated for 8 and 24 h with rat intestinal bacteria under anaerobic environment， respectively After the samples were precipitated by acetonitrile and extracted with ethyl acetate， LCQTOFMS/MS was applied for the qualitative analysis of the metabolites The potential metabolites in rat feces were analyzed by comparing the total ion current of the test samples and blank samples and analyzing the quasimolecular ion and fragment ion of all chromatograms The results showed that six saponins could be easily metabolized by rat intestinal bacteria Notoginsenoside R1 was mainly metabolized into five metabolites， and it′s metabolic pathway was notoginsenoside R1ginsenoside Rg1ginsenoside Rh1 and ginsenoside F1protopanaxatrioldehydrogenated protopanaxatriol Ginsenoside Rg1 was mainly metabolized into four metabolites， and it′s metabolic pathway was ginsenoside Rg1ginsenoside Rh1 and ginsenoside F1protopanaxatrioldehydrogenated protopanaxatriol Ginsenoside Rg2 was mainly metabolized into two metabolites， and it′s metabolic pathway was ginsenoside Rg2 protopanaxatrioldehydrogenated protopanaxatriol Ginsenoside Re was mainly metabolized into four metabolites， and it′s metabolic pathway was ginsenoside Reginsenoside Rg2ginsenoside F1protopanaxatrioldehydrogenated protopanaxatriol Ginsenoside Rd was mainly metabolized into four metabolites， and it′s metabolic pathway was ginsenoside Rdginsenoside Rg3 and ginsenoside F2ginsenoside Rh2protopanaxadiol Ginsenoside Rb1 was mainly metabolized into five metabolites， and it′s metabolic pathway was ginsenoside Rb1ginsenoside Rdginsenoside Rg3 and ginsenoside F2ginsenoside Rh2protopanaxadiol In summary， six saponins could be quickly metabolized by rat intestinal bacteria in vitro Their major metabolic pathways were deglycosylation and dehydrogenation
[Key words] rat intestinal bacteria； saponins； LCQTOFMS/MS； metabolism； deglycosylation
doi：10.4268/cjcmm20161226
肠道菌群是完成中药有效成分代谢的重要因素之一，开展肠道菌对中药复杂成分代谢规律的研究有助于阐明各类成分在体内的代谢过程以及发挥药效的机制，为中药复方作用物质基础的研究提供依据。但是中药复方制剂成分复杂，在体内的代谢机制及作用物质基础尚不明确，直接灌胃给药大鼠后研究其复杂成分体内代谢过程较为困难，因此本实验采用离体大鼠肠道菌孵育法首先系统地研究三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rg2，人参皂苷Re，人参皂苷Rd和人参皂苷Rb1这6种皂苷类成分的代谢过程，为后期含三七、人参中药复方制剂的体内外代谢研究奠定基础。
三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rg2，人参皂苷Re，人参皂苷Rd和人参皂苷Rb1是三七、人参等中药及相关中药复方的主要有效成分[14]，它们具有多种生理活性，包括调节内分泌，提高记忆力，扩张血管，降血压，抗肿瘤，抗疲劳，抗抑郁等药理作用[57]，但它们本身不易被吸收，生物利用度低，口服后主要在胃肠道内被代谢为活性更强的次级苷或苷元而发挥药效[89]，因此有必要对它们在肠道菌群中的代谢规律进行研究。虽有文献报道了肠道菌对人参皂苷Rg1和Rb1的代谢[1011]，但大鼠肠道菌对三七皂苷R1，人参皂苷Rg2，人参皂苷Re，人参皂苷Rd的研究目前未见报道，因此本研究将系统地研究并总结6种皂苷类在肠道菌中的代谢规律，为相似结构皂苷类成分肠道菌的研究提供参考。
1 仪器
Agilent 1290 infinity高效液相色谱仪和Agilent 6538 QTOF质谱仪（美国安捷伦公司）； HSC24A型氮吹仪（天津市恒奥科技发展有限公司）；超低温冰箱（海尔）；XW80A型涡旋混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；Centrifuge 5424型高速离心机（eppendorf）；Mettler AE 240型电子天平（梅特勒托利多仪器有限公司）；厌氧培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）；高压蒸气灭菌锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；MilliQ纯水仪（上海密理博有限公司）。
三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Re，人参皂苷Rd，人参皂苷Rb1，人参皂苷Rg2均购自中国食品药品检定研究院，批号分别为110745200617，110703201128，110754201123，111818201001，110704201223，20131120；K2HPO4・3H2O，（NH4）2SO4， MgSO4・7H2O，L半胱氨酸，L抗坏血酸和牛肉浸膏均购自国药集团化学试剂有限公司，批号20141201，20141222，20150113，20141015，20141015，20141104；KH2PO4，NaCl，CaCl2和Na2CO3均购自南京化学试剂有限公司，批号分别为13060720500，12061310972，10072220791，10112921212；胰蛋白胨购自Aladdin Industrial Corporation，批号H1414086；甲酸、乙腈为色谱纯，水为纯化水，其余为分析纯。
SPF级SD大鼠6只，雌雄各半，体重200～250 g，购于青龙山动物繁殖场，动物生产许可证编号20100002603360。
2 方法
21 药物储备液的制备
分别取三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rg2，人参皂苷Re，人参皂苷Rd和人参皂苷Rb1 2 mg，精密称定，加甲醇配制成10 g・L-1的储备液，置于4 ℃冰箱备用。
22 粪便的获取与处理
取一干净塑料袋，充满氮气，装入新鲜粪便，用手挤压使之匀质化。正常大鼠的新鲜粪便10 g与40 mL生理盐水（1∶4）混合制成悬浊液，2 000 r・min-1离心10 min后得上清液，即得肠菌液，肠菌液20 mL置于培养瓶中并加入30 mL的厌氧培养液，即得肠菌培养液，整个过程于N2流下操作。
23 厌氧培养基的制备
A：75 mL（078% K2HPO4）；B：375 mL[047% KH2PO4，118% NaCl，12% （NH4）2SO4，012% CaCl2，025% MgSO4・H2O]；C：50 mL（8% Na2CO3）；05 g L半胱氨酸，2 mL（25% L抗坏血酸），1 g牛肉浸膏，1 g蛋白胨，1 g营养琼脂；加超纯水适量，然后用1 mol HCl溶液将pH调至75～77，定容至1 000 mL。所获得的GAM分配于管，在115 ℃以007 MPa高压灭菌30 min，并储存在4 ℃或立即使用。
24 药物与肠道菌液的厌氧共培养
取上述大鼠肠菌培养液096 mL，添加 10 g・L-1三七皂苷R1人参皂苷Rg1人参皂苷Rg2人参皂苷Re人参皂苷Rd人参皂苷Rb1储备液20 μL，混匀溶解，再将混匀的溶液分装成2管（04 mL/管），于37 ℃厌氧条件下培养8， 24 h。加乙腈400 μL终止反应，漩涡振荡2 min，12 000 r・min-1离心10 min，用2倍乙酸乙酯萃取，涡旋，8 000 r・min-1离心10 min，取上清液，氮气吹干，100 μL甲醇复溶，12 000 r・min-1离心 10 min，取上清液待测。同时做不含药物和不含肠菌液的空白实验。每组平行3次。
25 LCQTOFMS/MS分析条件
251 色谱条件 Agilent ZORBAX SBC18色谱柱（21 mm×100 mm，18 μm）；柱温30 ℃；流速04 mL・min-1；进样量2 μL；流动相01%甲酸水溶液（A）乙腈（B），梯度洗脱，0～24 min，10%～37%B，24～34 min，37%～100%B，34～35 min，100%B，35～37 min，100%～10%B。
252 质谱条件 ESI离子源，干燥气流速80 L・min-1，干燥气温度350 ℃，雾化压力40 Pa，Skimmer 65 V，OCT 1 KF Vpp 750 V；负离子模式：毛细管电压3 500 V，裂解电压135 V，碰撞能量分别设定为30 V，离子扫描范围m/z 100～3 000，图谱采集频率15 spec・s-1。
3 结果
31 6种皂苷在离体大鼠肠道菌中的代谢产物分析
311 三七皂苷R1的代谢产物分析 与空白和阴性孵育样品相比，在三七皂苷R1孵育样品中除原形药（m/z 977527 3[M+COOH]-）外，共检测到5个代谢产物，见图1。m/z分别为845494 7（M1），683439 4（M2），683438 7（M3），521384 8（M4），519369 4（M5）。利用精确相对分子质量和质谱裂解规律，对代谢产物的结构进行鉴定。
三七皂苷R1：m/z 977527 3 [M+COOH]-的提取离子流色谱图中检测到1个色谱峰，保留时间为11936 min，分子式为C47H80O18，主要碎片离子m/z为931527 8，799484 3，637433 9，475375 6，与三七皂苷R1的相吻合。碎片离子m/z 977527 3[M-H]-，三七皂苷R1丢失1个木糖形成碎片离子m/z 799484 3，进一步丢失1个葡萄糖形成碎片离子m/z 637433 9，继续丢失1个葡萄糖形成碎片离子m/z 475375 6，结果见图1。
三七皂苷R1代谢产物M1：m/z 845494 7[M+COOH]-的提取离子流色谱图中，可以检测到1个色谱峰，保留时间为12936 min。根据精确相对分子质量，其比三七皂苷R1减少1个木糖，分子式为C42H72O14。在二级质谱图中，其主要碎片离子m/z 799476 6，637426 0，475377 0，见图1，碎片离子m/z 977527 3为[M-H]-，m/z 637426 0为M1丢失1个葡萄糖形成的碎片离子，m/z 475377 0为M1丢失2个葡萄糖形成的碎片离子，推测M1为人参皂苷Rg1。
三七皂苷R1代谢产物M2，M3：m/z 683439 4[M+COOH]-的提取离子流色谱图中，可以检测到2个色谱峰，保留时间分别为20073（M2），22309 min（M3）。根据精确相对分子质量，2个代谢产物的相对分子质量均比三七皂苷R1减少1个木糖和1个葡萄糖，它们是同分异构体，分子式为C36H62O9。在二级质谱图中，M2主要碎片离子m/z为637425 3[M-H]-和475372 5[M-H-Glc]-，M3主要碎片离子m/z为637433 6[M-H]-和475380 7[M-H-Glc]-，依据文献[12]，人参皂苷Rh1的极性大于人参皂苷F1，人参皂苷Rh1先于人参皂苷F1出峰，因此M2为人参皂苷Rh1，M3为人参皂苷F1，结果见图1。
三七皂苷R1代谢产物M4：m/z 521384 8 [M+COOH]-的提取离子流色谱图中，可以检测到1个色谱峰，保留时间为28154 min。根据精确相对分子质量，它比三七皂苷R1减少1个木糖和2个葡萄糖，分子式为C30H52O4。在二级质谱图中，M2主要碎片离子为m/z 475373 5[M-H]-，推测其为原人参三醇，见图1。
三七皂苷R1代谢产物M5：m/z 519369 4 [M+COOH]-的提取离子流色谱图中，可以检测到1个色谱峰，保留时间为29047 min。根据精确相对分子质量，它比原人参三醇（M4）减少2，分子式为
1。
312 人参皂苷Rg1的代谢产物分析 与空白和阴性孵育样品相比，在人参皂苷Rg1孵育样品中除原形药（m/z 845491 7[M+COOH]-）外，共检测到4个代谢产物，见图2。m/z分别为683435 2（M1），683430 7（M2），521382 1（M3），5193677（M4）。利用精确相对分子质量和质谱裂解规律，对代谢产物的结构进行鉴定。
人参皂苷Rg1：m/z 845491 7[M+COOH]-的提取离子流色谱图中检测到1个色谱峰，保留时间为13037 min，分子式为C42H72O14，主要碎片离子m/z为799484 8，637432 4，475380 1，与人参皂苷Rg1的相吻合。碎片离子m/z 799484 8[M-H]-，人参皂苷Rg1丢失1个葡萄糖形成碎片离子m/z 637432 4，进一步丢失1个葡萄糖形成碎片离子m/z 475380 1，见图2。
人参皂苷Rg1代谢产物M1，M2：m/z 683435 2 [M+COOH]-的提取离子流色谱图中，可以检测到2个色谱峰，保留时间分别为20242 min（M1）和22552 min（M2）。根据精确相对分子质量，2个代谢产物的相对分子质量均比人参皂苷Rg1减少1个葡萄糖，它们是同分异构体，分子式为C36H62O9。在二级质谱图中，M1主要碎片离子为m/z 637436 6[M-H]-和475383 4[M-H-Glc]-，M2主要碎片离子为m/z 637428 3[M-H]-和475375 5[M-H-Glc] -，结合文献[12]推测M1为人参皂苷Rh1，M2为人参皂苷F1，见图2。
人参皂苷Rg1代谢产物M3：m/z 521382 1[M+COOH]-的提取离子流色谱图中，可以检测到1个色谱峰，保留时间为28186 min。根据精确相对分子质量，它比人参皂苷Rg1减少2个葡萄糖，分子式为C30H52O4。在二级质谱图中，M2主要碎片离子m/z为475242 5[M-H]-，推测其为原人参三醇，见图2。
人参皂苷Rg1代谢产物M4：m/z 519367 7[M+COOH]-的提取离子流色谱图中，可以检测到1个色谱峰，保留时间为29060 min。根据精确相对分子质量，它比原人参三醇（M3）减少2，分子式为C30H50O4。在二级质谱图中，M2主要碎片离子m/z为475356 5[M-H]-，推测其为脱氢原人参三醇（原人参三醇羟基化后脱水的产物），见图2。
313 人参皂苷Rg2的代谢产物分析 与空白和阴性孵育样品相比，在人参皂苷Rg2孵育样品中除原形药（m/z 829497 9[M+COOH]-）外，共检测到2个代谢产物，见图3。m/z分别为521384 5（M1），519367 1（M2）。利用精确相对分子质量和
314 人参皂苷Re的代谢产物分析 与空白和阴性孵育样品相比，在人参皂苷Re孵育样品中除原形药（m/z 991554 0 [M+COOH]-）外，共检测到4个代谢产物，见图4。m/z分别为829495 6（M1），683434 0（M2），521382 7（M3），519364 6（M4）。利用精确相对分子质量和质谱裂解规律，对代谢产物的结构进行鉴定。
人参皂苷Re：m/z 991554 0 [M+COOH]-的提取离子流色谱图中检测到1个色谱峰，保留时间为13097 min，分子式为C48H82O18，主要碎片离子m/z为945543 6，799481 4，783486 6，637433 9，475375 6，与人参皂苷Re的相吻合。碎片离子m/z 945543 6为[M-H]-，人参皂苷Re丢失1个鼠李糖（146）形成碎片离子m/z 799481 4；丢失1个葡萄糖（162）形成碎片离子m/z 783486 6；丢失1个鼠李糖和1个葡萄糖（308）形成碎片离子m/z 637433 9，继续丢失1个葡萄糖（162）形成碎片离子m/z 475375 6，见图4。
人参皂苷Re代谢产物M1：m/z 829495 6 [M+COOH]-的提取离子流色谱图中，可以检测到1个色谱峰，保留时间为19967 min。根据精确相对分子质量，它比人参皂苷Re减少1个葡萄糖（162），分子式为C42H72O13。在二级质谱图中，M1主要碎片离子m/z为783488 7，637430 1，475377 9。碎片离子m/z 783488 7为[M-H]-，M1丢失1个鼠李糖（146）形成碎片离子m/z
315 人参皂苷Rd的代谢产物分析 与空白和阴性孵育样品相比，在人参皂苷Rd孵育样品中除原形药（m/z 991550 7[M+COOH]-）外，共检测到4个代谢产物，见图5，m/z分别为829497 3（M1），829495 3（M2），667444 3（M3），505388 3（M4），且8，24 h孵育样品中代谢产物不一致。利用精确相对分子质量和质谱裂解规律，对代谢产物的结构进行鉴定。
人参皂苷Rd：m/z 991550 7[M+COOH]-的提取离子流色谱图中检测到1个色谱峰，保留时间为23415 min，分子式为C48H82O18，主要碎片离子m/z 945548 6，783491 7，621435 9，459374 6，与人参皂苷Rd的相吻合。碎片离子m/z 945548 6[M-H]-，人参皂苷Rd丢失1个葡萄糖（162）形成碎片离子m/z 783491 7；继续丢失1个葡萄糖（162）形成碎片离子m/z 621435 9；进一步丢失1个葡萄糖（162）形成碎片离子m/z 459374 6，见图5。
人参皂苷Rd代谢产物M1和M2：m/z 829497 3 [M+COOH]-的提取离子流色谱图中，可以检测到2个色谱峰，保留时间分别为26689，27254 min（M2）。根据精确相对分子质量，2个代谢产物的相对分子质量比人参皂苷Rd减少1个葡萄糖（162），它们是同分异构体，分子式为C42H72O13。在二级质谱图中，M1主要碎片离子m/z为783485 9[M-H]-，621434 4[M-H-Glc]-和459381 4[M-H-Glc-Glc]-，M2主要碎片离子m/z为783485 9[M-H]-，621434 4[M-H-Glc]-和459381 4[M-H-Glc-Glc]-。依据文献[13]，人参皂苷F2的极性大于人参皂苷Rg3，人参皂苷F2先于人参皂苷Rg3出峰，因此M1为人参皂苷F2，M3为人参皂苷Rg3，见图5。
人参皂苷Rd代谢产物M3：m/z 667444 3[M+COOH]-的提取离子流色谱图中，可以检测到1个色谱峰，保留时间分别为29192 min。根据精确相对分子质量，它比人参皂苷Rd减少2个葡萄糖（324），分子式为C36H62O8。在二级质谱图中，M3主要碎片离子m/z为621435 2，459382 4，碎片离子m/z 621435 2为[M-H]-，M3丢失1个葡萄糖（162）形成碎片离子m/z 459382 4，推测M3为人参皂苷Rh2，见图5。
人参皂苷Rd代谢产物M4：m/z 505388 3 [M+COOH]-的提取离子流色谱图中，可以检测到1个色谱峰，保留时间为33110 min。根据精确相对分子质量，它比人参皂苷Rd减少3个葡萄糖（486），分子式为C30H52O3。在二级质谱图中，M3主要碎片离子m/z为459361 1[M-H]-，推测其为原人参二醇，见图5。
316 人参皂苷Rb1的代谢产物分析 与空白和阴性孵育样品相比，在人参皂苷Rd的8 h和24 h孵育样品中均未检测到原形药物，但共检测到5个代谢产物，见图6，m/z分别为991549 0（M1），829498 3（M2），829493 9（M3），667444 4（M4），505386 1（M5），且8，24 h孵育样品中代谢产物不一致。在阴性对照样品中检测到原型药物（m/z 1 107595 9 [M-H]-）。利用精确相对分子质量和质谱裂解规律，对代谢产物的结构进行鉴定。
人参皂苷Rb1：由于8，24 h孵育样品中均未检测到原形药物，因此对阴性对照样品进行分析，m/z 1 107595 9[M-H]-的提取离子流色谱图中检测到1个色谱峰，保留时间为20577 min，分子式为C54H92O23，主要碎片离子m/z 945536 3，783491 3，621425 9，459375 9，与人参皂苷Rb1的相吻合。人参皂苷Rb1丢失1个葡萄糖（162）形成碎片离子m/z 945536 3；继续丢失1个葡萄糖（162）形成碎片离子m/z 783491 3；进一步丢失1个葡萄糖（162）形成碎片离子m/z 621425 9，最后丢失1个葡萄糖（162）形成碎片离子m/z 459375 9，见图6。
人参皂苷Rb1代谢产物M1：m/z 991549 0[M+COOH]-的提取离子流色谱图中，可以检测到1个色谱峰，保留时间分别为23373 min。根据精确相对分子质量，它比人参皂苷Rb1减少1个葡萄糖（162），分子式为C48H82O18。在二级质谱图中，M1主要碎片离子m/z 945546 1，783490 5，
人参皂苷Rb1代谢产物M2和M3：m/z 829498 3[M+COOH]-的提取离子流色谱图中，可以检测到2个色谱峰，保留时间分别为26665（M2）和27330 min（M3）。根据精确相对分子质量，2个代谢产物的相对分子质量比人参皂苷Rb1减少2个葡萄糖（324），它们是同分异构体，分子式为C42H72O13。在二级质谱图中，M1主要碎片离子m/z 783493 3[M-H]-，621438 2 [M-H-Glc]-和459383 3[M-H-Glc-Glc]-，M2主要碎片离子m/z 783496 4[M-H]-，621444 2[M-H-Glc]-和459386 9[M-H-Glc-Glc]-，结合文献[13]推测M2为人参皂苷F2，M3为人参皂苷Rg3，见图6。
人参皂苷Rb1代谢产物M4：m/z 667444 4[M+COOH]-的提取离子流色谱图中，可以检测到1个色谱峰，保留时间分别为29181 min。根据精确相对分子质量，它比人参皂苷Rb1减少3个葡萄糖（486），分子式为C36H62O8。在二级质谱图中，M4主要碎片离子m/z为621436 6，459381 3，碎片离子m/z 621436 6[M-H]-，M4丢失1个葡萄糖（162）形成碎片离子m/z 459381 3，推测M4为人参皂苷Rh2，见图6。
人参皂苷Rb1代谢产物M5：m/z 505388 3[M+COOH]-的提取离子流色谱图中，可以检测到1个色谱峰，保留时间为33119 min。根据精确相对分子质量，它比人参皂苷Rb1减少4个葡萄糖（648），分子式为C30H52O3。在二级质谱图中，M4未见碎片离子，推测其为原人参二醇，见图6。
32 6种皂苷在离体大鼠肠道菌中的代谢途径分析
由代谢产物的鉴定结果可知，6种皂苷在离体大鼠肠道菌中的主要代谢途径为脱糖基和脱氢。6种皂苷主要分为原人参三醇型皂苷（三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rg2，人参皂苷Re）和原人参二醇型皂苷（人参皂苷Rd，人参皂苷Rb1），相同母核的皂苷类代谢途径也相似，6种皂苷类成分被肠道菌代谢主要可以生成11种不同的代谢产物，见图7，8。
4 讨论
本实验在体外模拟体内大鼠肠道菌群对6种皂苷类成分的生物转化，利用UPLCQTOFMS/MS技术对其代谢产物进行检测，采用空白对照法鉴别代谢物，通过对比分析空白对照样品和药物孵育样品的总离子流图和质谱数据，寻找药物孵育样品出现的新色谱峰，即可能为代谢产物。研究结果发现，6种皂苷经肠菌孵育后，除原型药物外，三七皂苷R1主要被代谢为5个产物，人参皂苷Rg1主要被代谢为4个产物，人参皂苷Rg2主要被代谢为2个产物，人参皂苷Re主要被代谢为4个产物，人参皂苷Rd主要被代谢为4个产物，人参皂苷Rb1主要被代谢为5个产物，代谢途径主要为去糖基化和脱氢。三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rg2，人参皂苷Re均属于原人参三醇型皂苷，人参皂苷Rd，人参皂苷Rb1均属于原人参二醇型皂苷，相同母核皂苷的化学结构中仅仅是糖基不同，因此它们的代谢产物有交叉。实验结果显示6种皂苷共可以生成11种不同的代谢产物。本研究结果为后期含三七、人参中药复方制剂的体内外代谢研究奠定基础。
本实验首次考察了6种皂苷在不同孵育时间点的代谢产物差异，发现6种皂苷孵育8，24 h时代谢产物均有差异。代谢产物人参皂苷Rh1和人参皂苷F2在8 h孵育样品中出现，但24 h孵育样品中未出现，可能是它们在孵育体系中不稳定，快速被代谢为其他产物。此外，除人参皂苷Rd外，其他皂苷的代谢产物原人参三醇和原人参二醇仅在24 h孵育样品中被检测到。本实验仅考察了2个孵育时间点的代谢产物差异，后续研究中有待进一步考察不同时间点代谢产物种类和代谢产物含量的变化。
此外，孵育样品进质谱前需要除盐和蛋白，因此，前期实验中本课题组对孵育样品的前处理进行了考察，分别考察了乙腈沉淀后乙酸乙酯萃取法，乙酸乙酯萃取法，固相萃取法，结果发现乙腈沉淀后乙酸乙酯萃取法对代谢产物的提取率最优，且未出现产物丢失现象，因此本实验直接选择了此法处理样品。后续研究中需要进一步考察不同极性溶剂提取效率。
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