芪白平肺胶囊含药血清介导NO对肺动脉平滑肌细胞KATP通道蛋白表达的影响
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[摘要] ^察不同低氧时段下，原代大鼠肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs） ATP敏感性钾通道（ATPsensitive potassium channel，KATP通道）蛋白的表达，探讨芪白平肺胶囊含药血清（简称QBPF）调控PASMCs KATP通道蛋白表达与一氧化氮（nitric oxide，NO）的相关性。清洁级SD大鼠给予芪白平肺胶囊颗粒连续灌胃10 d，制备芪白平肺含药血清。采用组织块贴壁法，体外培养原代大鼠肺动脉平滑肌细胞；Western blot检测不同低氧时间下Kir6.1和SUR2B的表达，以及在一氧化氮合酶抑制剂――Nω硝基L精氨酸甲酯（NωnitroLarginine methyl ester，LNAME）和KATP通道抑制剂――格列本脲（glyburide，GLYB）分别干预下，QBPF对其表达的影响。低氧6 h后Kir6.1和SUR2B蛋白表达开始上调，在低氧24 h达到高峰，低氧48，72 h的蛋白表达出现不同程度下调。在低氧24 h条件下，QBPF能进一步上调KATP通道Kir6.1和SUR2B蛋白表达，且这种上调作用能分别被KATP通道阻断剂GLYB和NO特异性阻断剂LNAME所阻断，提示芪白平肺胶囊具有明确的KATP通道开放作用，其机制可能通过介导NO相关途径上调KATP通道蛋白表达，参与肺血管舒张作用，缓解COPD的发生发展。
[关键词] 肺动脉平滑肌细胞； ATP敏感性钾通道； 一氧化氮； 含药血清
Effect of Qibai Pingfei capsule medicated serum on protein expressions of
katp channel in pulmonary arterial smooth muscle cells via nitric oxide
ZHU Jie1， LI Zegeng2，3*， WANG Baoqin4， TONG Xiangli4， PENG Qinghe1
（1. School of Integrated Traditional Chinese & Western Medicine， Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230038， China；
2. Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230038， China；
3. Institute of Medicine for Respiratory Disease， Anhui Academy of Chinese Medicine， Hefei 230038， China；
4. The First Affiliated Hospital， Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230031， China）
[Abstract] To investigate the ATPsensitive potassium channel （KATP channel） protein expressions during different periods under hypoxia condition and explore the effect of Qibai Pingfei capsule medicated serum （hereinafter referred to as QBPF） on the correlation between the protein expressions of KATP channel and nitric oxide in rat pulmonary arterial smooth muscle cells（PASMCs）. Qibai Pingfei capsules were given to SD rats via continuous gavage for 10 days to obtain QBPF. Primary rats PASMCs were cultured by the direct adherent culture method. Western blot was applied to detect the protein expression levels of KATP channel （Kir6.1 and SUR2B） in PASMCs. Then the noncompetitive inhibitor of NO synthase――NωnitroLarginine methyl ester（LNAME） and KATP channel inhibitor――glyburide（GLYB） were applied respectively to evaluate the effect of QBPF on the protein expressions of KATP channel. The protein expressions of Kir6.1 and SUR2B were increased after 6hour hypoxia treament， peaked at the 24hour hypoxia treament， and decreased in both 48hour and 72hour hypoxia groups. Especially， QBPF could further upregulate the Kir6.1 and SUR2B protein expressions under 24hour hypoxia condition； however， such upregulation effect could be blocked by KATP channel inhibitor GLYB and NO specific inhibitor LNAME， indicating that QBPF played the role of opening KATP channel. The regulatory mechanism was probably associated with upregulating KATP channel protein expression via NO relative pathway， involving pulmonary vasodilation， and thus relieving the occurence and development of COPD.
[Key words] pulmonary vascular smooth muscle cells； ATPsensitive potassium channel； nitric oxide； medicated serum
慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种发病率、致残率及病死率都很高的严重危害人民身体健康的慢性呼吸系统疾病[12]。肺动脉高压（pulmonary hypertesion，PH）是COPD的严重并发症之一，以肺血管阻力进行性增加和肺血管重构为主要特征[35]。益气化痰祛瘀方――芪白平肺胶囊（国家专利号ZL201010573274.1）用于治疗COPD，能有效缓解PH等并发症的进一步发展。前期研究表明，芪白平肺胶囊能有效上调一氧化氮（nitric oxide，NO）含量，改善低氧血症，舒张肺血管，但其具体作用途径有待进一步明确。近年来，ATP敏感性钾通道（ATPsensitive potassium channel，KATP通道）在低氧性肺动脉高压形成过程中的作用日趋受到关注。KATP通道由4个通道形成亚基内向整流钾通道（inward rectifier potassium channel，Kir）和4个调节亚基磺脲类受体（sulfonyurea receptor，SUR）亚基组成，存在于血管平滑肌细胞中[6]。KATP通道开放剂作为治疗COPD肺动脉高压等多种疾病的新型靶点药物，其通道的开放可能与NO关系密切[79]。因此，本次研究以原代大鼠肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs）为研究对象，观察不同低氧时段下，原代大鼠PASMCs中KATP通道亚基蛋白Kir6.1和SUR2B的表达，探讨芪白平肺胶囊含药血清（简称QBPF）调控PASMCs的KATP通道蛋白表达与NO的相关性，进一步阐明芪白平肺胶囊防治COPD的作用机制。
1 材料
1.1 动物 健康清洁级SD雄性大鼠，由安徽医科大学动物实验中心提供，动物许可证号SCXK（皖）2011002，其中体重（250±20） g大鼠用于含药血清的制备，体重（200±20） g大鼠用于原代大鼠PASMCs的培养。
1.2 药物与试剂 芪白平肺胶囊（安徽中医药大学第一附属医院制剂中心生产）；DMEM/F12培养基（Hyclone公司）；胎牛血清（Gibco公司）；青霉素链霉素（江苏碧云天生物技术研究所）；兔抗大鼠α肌动蛋白多克隆抗体（武汉三鹰生物科技有限公司）；兔抗大鼠Sur2B多克隆抗体（Santa Cruz公司）；山羊抗大鼠Kir6.1多克隆抗体（Abcam公司）；兔抗鼠βactin（北京中杉金桥生物技术有限公司）；山羊抗兔IgG/FITC标记（北京中杉金桥生物技术有限公司）；4′，6二脒基2苯基吲哚（4′，6diamidino2phenylindole，DAPI，Gene Copoeia公司）；格列本脲（glyburide，GLYB）、Nω硝基L精氨酸甲酯（LNAME），均购自Sigma公司。
1.3 仪器 Series 8000 WJ型三气培养箱（Thermo Fisher Scientific公司）；Z168型体视解剖显微镜（Motic公司）；IC 1000型Countstar自动细胞计数仪（上海睿钰生物科技有限公司）；TCS SP5型激光扫描共聚焦显微镜（Leica公司）；Western blot电泳、转膜装置（美国BIORAD公司）；SWCJ2FD型超净工作台（苏州净化有限公司）。
2 方法
2.1 制备芪白平肺胶囊含药血清 将芪白平肺胶囊内药粉研磨成末，以人临床等效量×动物等效量比值×血清稀释度为参考浓度，按1.0 g・kg-1给大鼠灌胃，每日2次，连续10 d，正常对照组给予等量生理盐水。于第11天，一次性灌胃全日量1 h后，无菌条件下腹主动脉取血，分离血清，每组大鼠的血清混合均匀，56 ℃补体灭活30 min，采用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌2次，分装密封后，置于冰箱-20 ℃保存备用。所取血清分别为正常空白血清、芪白平肺胶囊含药血清。
2.2 原代大鼠PASMCs的培养和鉴定 以水合氯醛 0.3 g・kg-1进行大鼠腹腔麻醉，体视解剖显微镜下，迅速分离肺动脉，采用组织块贴壁法，培养原代大鼠PASMCs。选择生长状态良好的3～8代PASMCs，在细胞对数生长期，用0.25%胰酶（含0.01%EDTA）消化，将PASMCs按细胞浓度1×105 个/mL接种于覆有盖玻片的24孔板内，放入37 ℃的恒CO2培养箱中培养，待细胞贴壁，采用细胞免疫荧光法鉴定PASMCs，经常规固定、一抗兔抗大鼠α肌动蛋白多克隆抗体、二抗山羊抗兔IgG/FITC标记、DAPI染色后，激光共聚焦显微镜下摄片。
2.3 Western blot检测PASMCs中Kir6.1，SUR2B蛋白水平 向培养板中加入含15%FBS的完全培养基，低氧（3%O2，5%CO2，92%N2）条件下，分别培养6，12，24，48，72 h，依次记为低氧6 h组、低氧12 h组、低氧24 h组、低氧48 h组、低氧72 h组，并设常氧组（20%O2，5%CO2，75%N2），培养24 h，记该组为低氧0 h组，分别于各时间段实验结束后，收集细胞。
将满足实验条件的细胞培养瓶，分为常氧组（常氧+20%正常空白血清）、低氧组（低氧+20%正常空白血清）、20%QBPF组（低氧+20%QBPF）、10%QBPF组（低氧+10%QBPF）、5%QBPF组（低氧+5%QBPF），QBPF各组分别加入相应的含药血清干预，不足20%浓度的部分，用正常空白血清补足，37 ℃培养箱孵育2 h，除常氧组，其余组放入三气培养箱低氧处理24 h。
将满足实验条件的细胞培养板，分为常氧组、低氧组、20%QBPF组（低氧+20%QBPF）、GLYB低剂量组（低氧+20%QBPF+1 μmol・L-1GLYB）、GLYB中剂量组（低氧+20%QBPF+10 μmol・L-1GLYB）、GLYB高剂量组（低氧+20%QBPF+100 μmol・L-1GLYB），在加入相应含药血清和不同浓度KATP通道阻断剂――GLYB后，37 ℃培养箱共孵育2 h，然后放入三气培养箱，低氧处理24 h。
将满足实验条件的细胞培养板，分为常氧组、低氧组、20% QBPF组（低氧+20%QBPF）、LNAME低剂量组（低氧+20%QBPF+1 μmol・L-1LNAME）、LNAME中剂量组（低氧+20%QBPF+10 μmol・L-1LNAME）、LNAME高剂量组（低氧+20%QBPF+100 μmol・L-1LNAME），在加入含药血清和不同浓度NO阻断剂――LNAME后，37 ℃培养箱共孵育2 h，然后放入三气培养箱低氧处理24 h。
PASMCs总蛋白提取与Kir6.1，SUR2B蛋白测定：分别与上述步骤结束后，收集细胞，提取蛋白，BCA蛋白定量，经上样、电泳、转膜、封闭后，一抗4 ℃ 孵育过夜，二抗室温孵育2 h，洗膜后，ECL发光试剂显影检测，计算各组Kir6.1和SUR2B蛋白的相对表达量。
2.4 统计学分析 所有数据采用SPSS 17.0统计软件进行分析。正态分布计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNKq检验，P
3 结果
3.1 原代大鼠PASMCs的形态特征与鉴定 原代大鼠肺动脉平滑肌组织块贴壁第3～5天可见贴壁附近有少量不规则长梭形细胞爬出，后呈放射性生长，约7～10 d成束的细胞平行排列，高低起伏，部分区域细胞呈多层重叠，呈现平滑肌细胞特征性的“峰谷”状致密分布。激光扫描共聚焦显微镜下，蓝色荧光为细胞核，呈长杆形或卵圆形；α肌动蛋白抗体呈阳性的细胞质中可见大量绿色荧光呈丝状分布，说明所培养的原代细胞为PASMCs，见图1。
3.2 不同时段低氧对PASMCs中Kir6.1和SUR2B蛋白表达的影响 与各低氧组相比，常氧状态下（即低氧0 h组），PASMCs中Kir6.1和SUR2B蛋白表达维持在较低水平（P
3.3 QBPF对PASMCs中Kir6.1和SUR2B蛋白表达的影响 与常氧组相比，低氧组、20%QBPF组、10%QBPF组5%QBPF组PASMCs中Kir6.1和SUR2B蛋白的表达均显著增加（P
3.4 GLYB对QBPF干预PASMCs Kir6.1和SUR2B蛋白表达的影响 与常氧组相比，低氧组、20%QBPF组PASMCs的Kir6.1和SUR2B蛋白的表达均显著增加（P
3.5 LNAME对QBPF干预PASMCs中Kir6.1和SUR2B蛋白表达的影响 与常氧组相比，低氧组、20%QBPF组PASMCs的Kir6.1和SUR2B蛋白的表_均显著增加（P
4 讨论
4.1 PASMCs是肺血管收缩的效应细胞 肺血管收缩是PH发生发展的重要病理环节之一，而慢性肺泡缺氧是PH形成的重要原因[1011]。COPD由于长期的气道阻塞造成肺泡缺氧及二氧化碳潴留，促使肺血管收缩，多出现缺氧性肺动脉高压，肺血管阻力进行性增加，最终可以导致右心室功能衰竭，甚至死亡[12]。PASMCs既是肺血管收缩的效应细胞，也是引起肺血管结构重建的细胞基础[1315]。正常生理状态下，PASMCs 处于较低的增殖水平，同时通过低水平的凋亡维持增殖/凋亡的动态平衡，但在低氧等刺激因素的作用下，PASMCs会发生大量的增殖、肥大，血管管壁增厚，促使肺血管紧张性增高，最终导致肺循环阻力进行性增大，诱发PAH[1618]。
4.2 KATP通道蛋白的表达具有一定的时间节律性 近年来，KATP通道在低氧性肺动脉高压形成过程中的作用日趋受到关注。考虑到KATP通道的多亚基型，内向整流钾通道Kir（Kir6.x）和硫脲类受体SUR（SUR1，2A，2B）按等比例分配在不同的组织细胞中。目前发现，人或大鼠肺动脉平滑肌细胞上存在的KATP通道主要由Kir6.1和SUR2B构成[1921]。在正常生理状态下，KATP通道基本不参与肺循环基础张力的调控，肺动脉平滑肌上的KATP通道由于生理浓度的ATP存在，基本处于关闭状态[22]。而当严重肺部缺氧时，由于细胞质内的ATP水平显著下降，致使KATP通道开放，缓解低氧性肺血管收缩，而这种肺动脉张力下降可被KATP通道阻断剂――GLYB所阻断，故提示KATP通道是缺氧严重时肺血管张力下降的原因[23]。随着低氧程度和低氧时间的不同，KATP通道呈现不同的开放或关闭状态：目前研究认为，轻度或中等程度的缺氧不伴有ATP的减少，故KATP通道不开放，但是持续性的低氧可使肺血管平滑肌钾通道功能受抑制，使细胞膜去极化，产生持续性的低氧性肺血管收缩，长期的肺泡缺氧，可导致渐进性肺血管重构、肺动脉高压[24]。
本次研究，采用M织块贴壁法成功分离、培养、鉴定出大鼠的肺小动脉平滑肌细胞，并制备不同浓度的芪白平肺含药血清，观察其对KATP通道蛋白表达的影响。为了能够动态观察，不同低氧条件下KATP通道的开放状况，因此，选择低氧6，12，24，48，72 h，动态检测KATP通道亚基Kir6.1和SUR2B的蛋白表达。结果显示，常氧状态下PASMCs中Kir6.1和SUR2B蛋白表达维持在较低水平，而随着低氧时间延长，低氧6 h后的Kir6.1和SUR2B蛋白表达逐步开始上升，代表KATP通道开放，在低氧24 h，蛋白表达达到高峰，随着低氧时间延长，低氧48，72 h的蛋白表达出现不同程度下调，从细胞水平验证了KATP通道的开放受缺氧时间和程度的影响。而芪白平肺胶囊含药血清均能显著上调肺动脉平滑肌细胞Kir6.1和SUR2B蛋白的表达，可以初步明确芪白平肺胶囊是一种KATP通道开放剂，参与肺血管舒张作用，缓解COPD的发生发展。
4.3 芪白平肺胶囊含药血清介导NO调控KATP通道蛋白表达 NO 作为内皮衍化舒张因子（endotheliumderived relaxing factor，EDRF），具有强大的舒张血管作用。同时，正常NO水平的维持，具有抑制肺血管平滑肌细胞的增殖和迁移、抑制血小板聚集，参与维持肺循环的稳态[25]。研究表明，适量的NO可选择性促进线粒体膜上的KATP通道开放，其机制可能是直接作用KATP通道内部具有NO 敏感性的氨基酸结合位点，开放KATP通道蛋白，也可通过NO/cGMP/PKG信号通路，介导KATP通道活性增加，参与血管舒张效应 [9，2627]。同时，激活KATP通道，可以上调内皮型一氧化氮合酶表达量，增加NO释放，发挥内皮保护作用[2829]。为了进一步探明NO通路与KATP通道在COPD肺动脉高压发生发展中的机制，本次研究观察了KATP通道阻断剂GLYB和NO特异性阻断剂LNAME分别干预下，对KATP通道蛋白表达的影响。研究结果表明，芪白平肺胶囊血清介导的KATP通道蛋白表达的上调作用能够分别被KATP通道阻断剂GLYB和NO特异性阻断剂LNAME所阻断，且随着阻断剂的浓度逐渐增加，KATP蛋白表达逐渐下调，进一步推断芪白平肺胶囊调控KATP通道的开放可能受到NO相关途径的调控，参与COPD肺动脉高压的防治。
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