瑶族药材千年健倍半萜类成分研究お

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[摘要]采用硅胶柱、ODS开放柱和半制备液相等色谱方法相结合，从千年健根茎乙醇提取物中的乙酸乙酯部位分离得到1.2个倍半萜类化合物，根据理化性质和波谱分析，化合物结构分别鉴定为 3α，7αdihydroxycadin4ene （1），3oxofabiaimbricatan （2），3β，4αdihydroxy7epieudesm1.1（1.3）ene （3），integrifonol A （4），1β，6βdihydroxy7epieudesm1.1（1.3）ene （5），4β，7β，1.1enantioeudesmantriol （6），epiguaidiol （7），oplopanone （8），（-）1β，4β，6αtrihydroxyeudesmane （9），2αhydroxyhomalomenol （10），（-）Tmuurolol （1.1），hamalomenol A （1.2）。 化合物1～7为首次从千年健属植物中分离得到，1.1～1.2为首次从该植物中分离得到。此外对分离的部分化合物进行了抑制脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞RAW 2.64.7细胞NO释放实验，发现化合物3，5和8有良好的抑制活性，其IC50分别为65.1，3.2.5，778 μmol・L-1。

[关键词]天南星科； 千年健属； 千年健； 化学成分； 抗炎

千年健，又称一包针、千颗针、千年见、丝棱线等，为双子叶植物天南星科千年健属植物千年健Homalomena occulta （Lour） Schott，产于广东、海南、广西、云南等地。根茎入药，是中国药典收载品种，为瑶族群众所习用，可治跌打损伤、骨折、外伤出血、四肢麻木、筋脉拘挛、风湿腰腿痛、类风湿关节炎、胃痛、肠胃炎、痧症等疾病[12]。近年来，该药材的化学成分已有一些研究报道，主要含有倍半萜类化合物、酚酸类等化合物[37]。为进一步阐明该药材的化学成分，寻找抗类风湿性关节炎的药效成分，对千年健的根茎乙醇提取物进行了化学成分研究，分离得到1.2个倍半萜类化合物，分别为3α，7αdihydroxycadin4ene （1），3oxofabiaimbricatan （2），3β，4αdihydroxy7epieudesm1.1（1.3）ene （3），integrifonol A （4），1β，6βdihydroxy7epieudesm1.1（1.3）ene （5）， 4β，7β，1.1enantioeudesmantriol （6），epiguaidiol （7），oplopanone （8），（-）1β，4β，6αtrihydroxyeudesmane （9），2αhydroxyhomalomenol （10），（-）Tmuurolol （1.1），hamalomenol A （1.2）。 化合物1～7为首次从千年健属植物中分离得到，1.1～1.2为首次从该植物中分离得到。此外，对分离的部分化合物进行了抑制脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞 RAW 2.64.7的NO释放实验，筛选具有抗炎活性的化合物。

1 材料

INOVA500MHzFT核磁共振仪，TMS为内标物；Agilent 63.20型ESI质谱仪；Waters 1.5.2.5半制备型高效液相色谱仪（2.998 PDA检测器）；Agilent XDB C1.8色谱柱（94 mm× 2.50 mm， 5 μm），超纯水仪（MilliporeQ），暗箱式紫外分光仪（WD9403C型），旋转蒸发仪（EYELA 1000），Thermo 3.1.11型二氧化碳培养箱（美国热电公司），Motic AE2000倒置荧光显微镜，TELSTAR AV30型超净工作台，Thermo Multiskan FC多功能酶标仪。薄层色谱和柱色谱用硅胶（青岛海洋化工厂）；十八烷基硅烷键合硅胶（ODS）柱色谱材料（安捷伦）；薄层色谱和柱色谱用石油醚（60～90 ℃）、丙酮、氯仿、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇等试剂为分析纯，液相用甲醇为色谱纯（Fisher公司产品），水为MilliQ纯化水。DMEM培养基（Hyclone，美国）；胎牛血清（Gibco，美国）；NO化学法试剂盒（南京建成生物工程有限公司）；槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院）。

小鼠巨噬细胞RAW 2.64.7细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

千年健药材201.3年7月采购于广西玉林药材市场（产地广西桂林），经北京大学药学院天然药物学系屠鹏飞教授鉴定为天南星科千年健属植物千年健H occulta的干燥根茎，标本（QNJ201.30701）保存于华侨大学化工与制药工程系标本库。

2 提取与分离

干燥千年健根茎200 kg，粉碎后用体积分数95%乙醇回流提取3次，合并3次提取液，减压浓缩得浸膏。取浸膏加适量水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物3.20 g，乙酸乙酯萃取物1.10 g，正丁醇萃取物60 g。乙酸乙酯部分（100 g）经硅胶柱色谱，以氯仿甲醇（10∶0～10∶5 ）梯度洗脱，TLC检测后主斑点一致或相近的合并，共得10个组分（Fr1～Fr10）。Fr1（5 g）经硅胶柱色谱，以石油醚丙酮（10∶1～0∶1）梯度洗脱，得4个流分（Fr1.1～Fr1.4）；其中Fr1.2依次经RPC1.8反相柱（甲醇水，6∶4～9∶1梯度洗脱），再经半制备液相（甲醇水，5.5%甲醇）分离得到化合物1 （105 mg）和2 （50 mg）；Fr1.3依次经RPC1.8反相柱（甲醇水，6∶4～9∶3梯度洗脱），再经半制备液相（5.2%甲醇）分离得到化合物3 （87 mg），4 （1.20 mg），5 （5.2 mg）。Fr1.4经硅胶柱色谱，依次经RPC1.8反相柱（甲醇水，6∶4～9∶3梯度洗脱），再经半制备液相（50%甲醇）分离得到化合物6（100 mg）和7 （4.5 mg）。Fr4（1.2 g）以石油醚丙酮（1.5∶1～0∶1）梯度洗脱，得6个流分（Fr4.1～Fr4.6）；其中Fr4.2经硅胶柱色谱（石油醚丙酮，20∶1～0∶1梯度洗脱），分离得到化合物8 （100 mg）；Fr4.4经硅胶柱色谱（石油醚丙酮，10∶1～0∶1梯度洗脱），分离得到化合物9 （1.2.5 mg）和10 （50 mg）；Fr4.5经硅胶柱色谱（石油醚乙酸乙酯，5∶1～0∶1梯度洗脱），分离得到化合物1.1 （1.5.5 mg）；Fr4.6经硅胶柱色谱（石油醚乙酸乙酯，5∶1～0∶1梯度洗脱），分离得到化合物1.2 （85 mg）。

3 结构鉴定

4抗炎活性测定

采用Griess法测定化合物1～1.2对小鼠巨噬细胞RAW2.64.7细胞生成NO的抑制作用。RAW2.64.7细胞用高糖DMEM培养基（加10%胎牛血清，100 μg・L-1青霉素和100 μg・L-1链霉素）于3.7 ℃，5% CO2的培养箱中培养，每1 d传代1次。实验分为对照组、LPS诱导组（1 mg・L-1）、槲皮素阳性组、不同化合物给药组（40 μmol・L-1），对照组采用上述高糖DMEM补充体积，其他组用LPS（1 mg・L-1）诱导炎症，阳性组采用槲皮素处理细胞，化合物采用多个剂量协同LPS（1 mg・L-1）处理细胞，以2×105个/mL密度接种于96孔板，每组3个复孔，加药2 h后，加入LPS（1 mg・L-1），刺激维持2.4 h后，吸取培养液上清（300 μL），采用Griess法测定NO浓度，酶标仪5.40 nm波长检测吸光度（A）。

结果显示，化合物3，5和8显示对RAW2.64.7细胞NO 生成具有较强的抑制作用，其IC 50分别为65.1，3.2.5，778 μmol・L-1，阳性对照槲皮素的IC 50为4.85 μmol・L-1；其他化合物的IC 50大于10 μmol・L-1。

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