白芍总苷对2型糖尿病大鼠肾组织Wnt/β―catenin信号通路表达的影响
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[摘要]该实验研究白芍总苷对2型糖尿病大鼠肾组织wnt/β-catenin信号通路表达的影响，探讨白芍总苷对糖尿病大鼠肾脏损伤的保护作用及可能机制。实验采用高糖高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素（STZ）诱导2型糖尿病大鼠，动物分为正常对照组，糖尿病对照组，白芍总苷低、中、高剂量治疗组 （50，100，200 mg・kg-1）及阳性对照组 （雷公藤多苷8 mg・kg-1），灌胃给药，每日1次，14周末检测大鼠空腹血糖，血肌酐，尿素氮，24 h尿蛋白；光镜观察肾组织形态学的改变；病理图像系统分析平均肾小球面积及平均肾小球体积；免疫组织化学及Western blot检测肾组织Wnt-1，β-catenin蛋白表达；逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测肾组织Wnt-1，β-catenin mRNA表达。研究发现高糖高脂诱导的2型糖尿病大鼠肾组织Wnt-1，β-catenin表达增高。与糖尿病对照组比较，各治疗组大鼠血肌酐，尿素氮，24 h尿蛋白，平均肾小球面积，平均肾小球体积显著降低，肾组织病理形态学明显改善；Wnt-1， β-catenin mRNA及蛋白表达显著减少。综上所述，2型糖尿病大鼠肾组织Wnt/β-catenin信号通路异常活化，白芍总苷可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路活化，改善糖尿病大鼠肾脏损害，延缓糖尿病肾病的发生发展。
[关键词]糖尿病肾病；白芍总苷；Wnt-1；β-catenin
随着人们生活水平的提高，全球糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者已超过1.7亿，无论是1型还是2型DM，大约30%～40%的患者可出现肾脏损害，即糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN），是终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）主要原因，约占全部ESRD病例的44%，严重影响患者的生存质量[1]。目前DN的发病机制多认为与细胞内信号转导、免疫反应、代谢紊乱及肾素-血管紧张素系统（RAS）紊乱等有关。研究表明，Wnt/β-catenin信号通路异常激活可诱导足细胞nephrin分子表达下调和蛋白尿的发生，阻断该通路的表达则会减轻足细胞损伤[2-3]；异常的Wnt通路导致肾小球系膜细胞增殖或肾纤维化，从而影响DN发生发展[4]。药理及临床研究发现白芍总苷（total glucosides of paeony，TGP）具有抗炎、调节免疫、镇痛等功效，近年来白芍总苷已被广泛应用于多种肾脏疾病的临床治疗。经文献检索，国内外尚无文献报道白芍总苷对Wnt/β-catenin通路干预性研究。本文旨在研究白芍总苷对2型糖尿病大鼠肾组织Wnt/β-catenin信号通路表达的影响，为白芍总苷在临床糖尿病肾病治疗中的应用提供理论及实验依据。
1 材料
1.1 动物 90只健康清洁级雄性SD大鼠，体重180～220 g，周龄8周，由蚌埠医学院实验动物中心提供，许可证号SYXK（皖）2012-0002，在蚌埠医学院实验动物中心屏障设施内饲养。
1.2 药品和试剂 白芍总苷，宁波立华制药有限公司，批准文号国药准字H20055058，用前以0.5%羧甲基纤维素钠配制混悬液；羧甲基纤维素钠，湖南尔康制药有限公司；枸橼酸和枸橼酸钠，台山市新宁制药有限公司；链脲佐菌素（STZ），美国 Sigma公司；强生稳步血糖测定仪及试纸，美国强生公司；兔抗Wnt-1多克隆抗体，Santa Cruz Biotechnology；鼠抗β-catenin单克隆抗体，Santa Cruz Biotechnology；免疫组化试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司；Western blot相关试剂和RIPA裂解液及BCA蛋白浓度测定试剂盒，江苏碧云天生物研究所公司；Trizol总RNA抽提试剂盒、RT-PCR试剂盒及引物合成，上海生工生物工程有限公司。
1.3 仪器 ME204电子分析天平（梅特勒托利多仪器有限公司）；LE438酸度计/pH计（梅特勒托利多仪器有限公司）；ZF-90型多功能暗箱式紫外透射仪（上海顾村电光仪器厂）；梯度PCR 扩增仪（德国Biometra Tgradient）；Tanon GIS-3500GIS凝胶成像分析系统（上海天能科技有限公司）；DY-A电泳仪（上海生化所申华生化技术开发公司）；DYY-Ⅲ32型琼脂糖水平电泳槽（北京六一仪器厂）；Sanyo Ultra Low NDF-382超低温冰箱（日本）。Eppendorf-5810R冷冻高速离心机（德国）；OLYMPUS 5800型全自动生化分析仪（日本）；OLYMPUS显微镜（BX40）；RM2245切片机（德国LEICA 切片机）。
2 方法
2.1 动物模型建立及分组 8周龄SD雄性大鼠，体重180～220 g，普通饲料适应性喂养1周，采用随机数字表法随机分为糖尿病模型组80只和对照组10只。糖尿病模型组给予高糖高脂饲料（含20%蔗糖、10%猪油、2.5%胆固醇、1.0%胆酸盐、66.5%常规饲料），对照组给予颗粒型普通饲料喂养。糖尿病模型组大鼠高糖高脂饲料喂养4周，禁食12 h后，一次性右下腹腹腔注射由枸橼酸钠溶液（0.1 mol・L-1，pH 4.2）配制的STZ 35 mg・kg-1，诱导2型糖尿病大鼠模型，对照组同时给予等量的枸橼酸钠溶剂。72 h后尾静脉采血，空腹血糖>16.7 mmol・L-1为胰岛素敏感性降低，符合此标准的大鼠确定为2型糖尿病大鼠[5]。6只随机血糖
2.2 标本收集 实验期间观察大鼠毛色、体重及精神状态，监测血糖。14周末用代谢笼收集24 h尿，测尿蛋白。2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，留取血标本送检血肌酐、尿素氮、血糖，由全自动生化分析仪检测；取左侧肾脏标本，称肾重，计算肾脏指数（肾重/100 g 体重）。右肾组织，部分-80 ℃的低温冰箱冻存，用于RT-PCR及Western blot检测，部分用10%甲醛固定作病理学检查。
2.3 肾脏病理组织学检查 右侧肾脏组织行PAS染色，PAS染色切片高倍镜（×400）每个标本随机选择5个肾小球，应用显微摄影系统摄取图像，采用Image J 图像分析软件测量肾小球面积，5个肾小球面积平均值为此标本平均肾小球面积（mean glomerular area，MGA），并根据公式[6]，平均肾小球体积（mean glomerular volume，MGV）=1.25×[MGA]3/2，计算平均肾小球体积。肾组织Wnt-1，β-catenin免疫组化染色采用SP法，按照试剂盒操作说明进行操作，阳性物质呈棕黄色颗粒状。Wnt-1，β-catenin免疫组化结果判断：在高倍视野（×400）下测定Wnt-1，β-catenin的量，以灰度值表示，数值越小，表示染色越深，阳性强度越高，每张标本随机测定5个视野，以其均值作为该标本的最后结果。
2.4 半定量RT-PCR测定肾组织Wnt-1，β-catenin mRNA表达 取-80 ℃冻存大鼠肾组织，按总RNA提取试剂盒说明提取总RNA，紫外分光光度计测量浓度，按照试剂盒说明完成RT-PCR。Wnt-1，β-catenin基因特异性引物根据GenBank Wnt-1，β-catenin基因cds序列，由上海生工生物工程股份有限公司设计及合成，Wnt-l上游引物：5′-GGTGGG GCATCGTGAACATAG-3′，下游引物：5′-GGAGGTGATTGCGAAGATAAACG-3′，扩增产物片段长度为296 bp；β-catenin上游引物：5′-GCTGACCAAACTGCTAAATGACGA-3′，下游引物：5′-TGTAGGGTCCCAGCGGTACAA-3′，扩增产物片段为192 bp；另设计及合成1对片段长度为432 bp的大鼠β-actin基因引物作为内参，上游引物5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′，下游引物5′-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3′。PCR反应体系总体积为25 μL；PCR扩增条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 40 s 35个循环，72 ℃ 10 min。然后取PCR 产物5 μL 与上样缓冲液充分混匀后，于1.5%琼脂糖凝胶电泳，GIS凝胶图像处理系统中拍摄记录并使用图像分析软件行光密度扫描作半定量分析，以Wnt-1，β-catenin的吸光度与β-actin吸光度的比作为Wnt-1，β-catenin的基因表达半定量值。
2.5 Western blot检测肾组织Wnt-1，β-catenin蛋白的表达 在液氮中研磨肾组织成微末，收集100 mg，采用RIPA细胞裂解液提取总蛋白，取上清液BCA法测蛋白浓度。蛋白样品在100 ℃变性6 min，各取样品20 μL行SDS-PAGE电泳分离并转至PVDF膜，在含5%脱脂奶粉封闭液中封闭1 h，加入Wnt-1，β-catenin，β-tubulin一抗，4 ℃过夜，次日回收一抗在TBST液中洗膜30 min，将膜置于1∶5 000稀释的二抗，37 ℃反应2 h。TBST洗膜后，取出PVDF膜，置于DAB显色液显色、定影，凝胶成像系统成像。β-tubulin蛋白作为内参。结果以各组Wnt-1，β-catenin，β-tubulin电泳条带灰度值比值表示。
2.6 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件，各组计量数据采用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用t 检验。
3 结果
3.1 各组大鼠生化指标观察 14周末糖尿病组及各治疗组较对照组血糖、血清肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白定量均显著升高 （P
3.2 各组大鼠肾脏指数及肾脏病理组织学观察 14周末糖尿病组及糖尿病各用药组肾脏指数较对照组明显增高，各治疗组肾脏指数较糖尿病组显著降低。光镜观察，对照组大鼠肾组织结构正常。14周末糖尿病组肾小球明显增大，肾小球系膜细胞增生，系膜基质中或重度增加，基底膜增厚明显；部分肾小管上皮细胞空泡变性，肾间质伴有炎性细胞浸润；白芍总苷各治疗组及雷公藤多苷治疗组较糖尿病组上述病变有不同程度的改善。图像分析显示糖尿病组大鼠MGA及MGV较正常组明显增大，白芍总苷各治疗组较糖尿病组明显减小，白芍总苷可减轻糖尿病大鼠肾小球肥大，与雷公藤多苷具有相似的效应，见图1，表2。
3.3 各组大鼠肾组织Wnt-1，β-catenin免疫组化观察 Wnt-1，β-catenin在对照组肾组织仅有部分肾小球和肾小管极弱表达，Wnt-1，β-catenin在糖尿病组大鼠肾小球及肾小管均有表达，糖尿病组肾小球和肾小管Wnt-1，β-catenin表达明显高于对照组，白芍总苷各治疗组肾小球及肾小管区Wnt1，βcatenin表达与糖尿病组相比明显减弱（P
3.4各组大鼠肾组织Wnt1，βcatenin mRNA表达 半定量RTPCR结果显示Wnt1，βcatenin mRNA在对照组大鼠肾组织中弱表达，糖尿病组较对照组明显增加（P
3.5各组大鼠肾组织Wnt1，βcatenin 蛋白表达 Western blot结果显示Wnt1，βcatenin蛋白在对照组大鼠肾组织中弱表达，糖尿病组较对照组明显增加（P
4 讨论
糖尿病肾病是糖尿病的主要慢性并发症之一，是导致终末期肾病的主要原因， 并且行肾脏替代治疗的糖尿病肾病患者预后相对较差。糖尿病肾病发生发展的确切机制不明，目前研究认为与细胞信号转导、糖代谢紊乱、血流动力学改变、氧化应激、免疫炎症反应、细胞因子以及遗传背景等多种因素综合作用有关[7-9]。近年来Wnt/β-catenin信号通路在慢性肾脏病中的作用受到人们的重视，Wnt/β-catenin信号通路在肾脏发育中发挥重要作用，但在成熟肾脏组织Wnt/β-catenin信号通路处于静止状态。在病理状态下，Wnt/β-catenin信号通路可重新活化，参与许多慢性肾脏疾病的发生发展，如蛋白尿、多囊肾、肾脏间质纤维化及肾脏肿瘤等[10]。经文献检索，Wnt信号通路参与糖尿病肾病发生发展，Wnt-4，Wnt-5a信号通路报道较多，而Wnt信号通路经典途径Wnt-1，β-catenin在糖尿病动物模型表达情况的国内外研究报道较少。2型糖尿病患者占糖尿病患者的绝大部分，因此本研究结合文献[5]，先以高糖高脂饲料喂养大鼠，引起大鼠外周胰岛素抵抗，再给予小剂量STZ使β细胞受损，胰岛素分泌相对减少，引起高血糖，此糖尿病大鼠模型的建立类似人2型糖尿病的发病进程，以其作为研究对象，观察2型糖尿病大鼠肾组织Wnt-1，β-catenin的表达情况及白芍总苷干预后对其表达的影响，并以雷公藤多苷作为阳性药物对照。本实验14周末模型组大鼠尿蛋白定量大于30 mg・d-1，血肌酐、尿素氮较对照组增高，肾脏指数较对照组增大，肾小球面积及肾小球体积增大，肾小球出现系膜细胞及基质增生、增殖，符合糖尿病肾脏损害的特征。
Wnt信号是调控细胞生长增殖的关键途径，在胚胎发育和肿瘤发生中具有重要作用[11]。Wnt信号通路包括经典Wnt/β-catenin信号通路和非经典信号通路。Wnt蛋白表达是Wnt信号通路活化的重要起始信号。现已知主要有19种Wnt蛋白，参与Wnt经典信号通路的有wnt-1，Wnt-3a，Wnt-8等，参与非经典信号通路的有Wnt-4，Wnt-5a，Wnt-11等。β-catenin是由CTNNB1基因编码的一种多功能蛋白质，具有介导信号转导和细胞间黏附两大功能，β-catenin在Wnt/β-catenin信号通路中处于中心位置，其在细胞内的状态和数量对该途径具有决定性影响，因此被认为是该信号途径激活的标志。已有研究证明，经典信号通路可以激活细胞周期蛋白 D1（cyclinD1），编码细胞因子VEGF基因、IL-8的基因、编码细胞外基质有关成分（基质金属蛋白酶，MMP-7）的基因及胰升血糖素样多肽l （GLP-1） ，CD44，survivin等[12]，而VEGF，IL-8，基质金属蛋白酶，GLP-1，CD44等异常参与糖尿病肾病发生发展[13-15]，因此可推测Wnt/β-catenin活化参与糖尿病肾病的发生发展。而且，近来研究发现DN时Wnt信号通路存在活化异常，可导致多种与免疫、炎症反应相关的细胞因子、炎症介质，如IL-1，IL-2，IL-6，TNF-α等的生成[16]。高糖可诱导足细胞发生表型转化，而Wnt/β-catenin信号通路可能参与了高糖诱导的足细胞表型转化[10]。在糖尿病肾病及局灶节段性肾小球硬化的患者足细胞中可见Wnt-1和β-catenin的高表达，异常增高的Wnt-1和β-catenin可抑制nephrin的表达诱导足细胞损伤[2-3]。本实验通过2型糖尿病肾病模型证实，正常对照组大鼠肾组织Wnt-1，β-catenin弱表达，糖尿病大鼠肾组织Wnt-1，β-catenin表达增高，表明Wnt-1，β-catenin异常活化参与糖尿病肾病的发生发展。
白芍总苷具有抗炎、镇痛和调节免疫等作用。白芍总苷已被广泛应用于系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎等多种自身免疫性疾病的治疗。近年来白芍总苷已被广泛应用于多种肾脏疾病的临床治疗。动物实验研究证明白芍总苷对糖尿病肾病具有保护作用，白芍总苷呈剂量依赖性降低糖尿病大鼠24 h尿白蛋白排泄率，白芍总苷可明显改善糖尿病大鼠肾损害，其机制与其调节肾脏固有细胞增殖，抑制肾组织内巨噬细胞的浸润及增殖有关[16]。白芍总苷可通过抑制糖尿病肾组织过高细胞黏附因子-1、 白介素-1， 肿瘤坏死因子-α及3-硝基酪氨酸表达对糖尿病大鼠早期肾脏损伤起保护作用[18]。白芍总苷可明显降低糖尿病大鼠肾组织中TLR2，TLR4和NF-κB-p-p65蛋白的表达，提示白芍总苷对DN的保护作用与抑制TLR2，4/NF-κB通路相关[19]。本实验通过白芍总苷对2型糖尿病大鼠干预后发现，14周末2型糖尿病大鼠肾组织Wnt-1，β-catenin表达降低，且肾脏损伤指标尿蛋白、血肌酐、尿素氮、肾小球面积及肾小球体积较糖尿病对照组明显改善，具有与雷公藤多苷相似的效应，提示白芍总苷对糖尿病大鼠肾脏损害具有保护作用，部分机制与抑制Wnt/β-catenin信号通路活化有关，并且白芍总苷对Wnt/β-catenin信号通路抑制呈剂量依赖性。
综上所述，2型糖尿病大鼠肾组织Wnt/β-catenin异常活化参与糖尿病肾病发生发展，白芍总苷对糖尿病大鼠肾脏损害具有保护作用，部分机制与抑制Wnt/β-catenin信号通路活化有关，为白芍总苷临床治疗糖尿病肾病提供理论依据。
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Effect of total glucosides of paeony on Wnt/β-catenin signal transduction
pathway expression in kidney of diabetic rats
CHANG Bao-chao1， CHEN Wei-dong1*， ZHANG Yan1， YANG Ping2， LIU Lei1， WANG Jing1
（1.Department of Nephrology， the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College， Bengbu 233000， China；
2.Department of Laboratory， the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College， Bengbu 233000， China）
[Abstract] The study is to explore the effect of total glucosides of paeony（TGP）on Wnt/β-catenin signal transduction pathway expression in kidney of diabetic rats， and discuss the protection of TGP in diabetic nephropathy and possible mechanism. Ninety male SD rats of 8 weeks age were randomly divided into normal control group （n=10） and model group（n=80）.Rats of the normal control group were fed with regular diet，while rats of the model group were fed with high-fat high-sugar diet and 4 weeks later were given an intraperitoneal injection of 35 mg・kg-1 streptozotocin （STZ）.The successfully induced type 2 diabetic rat models were then randomly divided into DM group，three TGP （50，100，200 mg・kg-1・d-1） treatment group and tripterygium wilfordii glycosides （8 mg・kg-1・d-1） control group.Rats of DM group and each treatment group were given high-fat high-sugar diet. At week 14，the levels of blood sugar， 24 hour urine protein， serum creatinine and blood urea nitrogen were tested. The rats were then sacrificed.Renal pathological changes were examined.Renal tissue Wnt-1 and β-catenin expressions were detected by immunohistochemical assay.Wnt-1 mRNA and β-catenin mRNA expression was semi-quantified by RT-PCR. Wnt-1 protein and β-catenin protein expression was semi-quantified by Western blot. The Result show that Wnt-1 and β-catenin expression increased in kidney of high-fat high-sugar induced type 2 diabetic rats. Compared with diabetic group ， the level of serum creatinine， blood urea nitrogen， 24 h urine protein， mean glomerular area and mean glomerular volume were decreased， renal histopathology were improved， expression of Wnt-1 and β-catenin mRNA and protein was reduced in TGP group. Tripterygium wilfordii glycosides had the similar effect. In conclusion， these results showed that Wnt/β-catenin abnormal activation in kidney of type 2 diabetic rats， TGP can improve kidney damage in diabetic rats and delay the development of diabetic nephropathy by inhibit the Wnt/β-catenin signaling pathway.
[Key words] diabetic nephropathy； total glucosides of paeony； Wnt-1； β-catenin
doi：10.4268/cjcmm20141933