栽培蓝莓―园蓝的抗氧化活性及其活性化合物的定性定量

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摘要：为测定栽培蓝莓-园蓝果实中的抗氧化活性及其总花色苷含量，以贵州产园蓝鲜果为原料，经甲醇处理、大孔吸附树脂分离得出抗氧化活性最好的部位。然后对其进行了制备分离得到一单体化合物，经1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS进行了结构鉴定，利用Rp-HPLC进行了该化合物的含量测定。以该化合物为对照品，对园蓝果实中总花色苷含量进行了定量分析。研究表明：贵州产园蓝提取物富含花青素部分1mg/mL浓度的抗氧化活性与等浓度的维生素C的活性相当，鉴定的单体化合物为锦葵色素-3-O-葡萄糖，其纯度达96%，园蓝鲜果中总花青素平均含量为627.7mg/100g。指出了园蓝鲜果花色苷含量高，主成分为锦葵色素-3-O-葡萄糖，花青素具有较好的抗氧化活性。建议每人每天食用2g园蓝鲜果作为人体补充抗氧化剂的来源。

关键词：园蓝；抗氧化性；花色苷；锦葵色素-3-O-葡萄糖

中图分类号：R284文献标识码：A文章编号：16749944（2014）11007704

1引言

兔眼蓝莓为杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium）野生兔眼越橘（Vaccinium ashei Reade）类品种中选育出来的栽培品种，因果实成熟前其颜色红如兔眼而得名。园蓝（Gardenblue）为兔眼蓝莓栽培品种之一。蓝莓具有丰富的营养价值，果实富含花青素、维生素、黄酮类化合物等[1]。花青素（Anthocyanin）又名花色素，属类黄酮类化合物，是一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，多以糖苷形式存在，又称花色苷。蓝莓花青素种类丰富，有报道的花色苷有18种[2]。不同越橘品种总花青素含量差别较大。杨桂霞等对16种越桔果鲜果的花色苷含量做了测定，结果花色苷含量为258.76～613.18mg/100g[3]。花青素具有很多生物活性，如抗氧化活性，Li-Qion等研究发现飞燕草色素和花青素-3-O-葡萄糖为蓝莓中主要抗氧化活性成分[4]；抗肿瘤活性，Andrea Bunea等研究发现蓝莓栽培品Torro的花青素（ARF-T）含量超过500μg/mL时，对转移性黑色素瘤B16-F10小鼠细胞的增殖具有一定的抑制作用，同时ARF-T能够诱导细胞凋亡和提高脾细胞对肿瘤细胞杀伤活性[5]；同时还具有降脂[6]、预防心脑血管疾病、保护肝脏、降低DNA氧化损伤[7]等多种生物活性。目前蓝莓总花青素含量测定方法主要有紫外、pH示差法及HPLC等，其中HPLC法快速、稳定、方便、可靠[2]。本文以蓝莓品种园蓝的甲醇提取物为原料，采用活性追踪的方法，对活性最好的部分进行分离纯化，采用1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS技术对得到花色苷进行结构鉴定，并将其作为标准品，采用HPLC法测定园蓝中总花青素含量。

2仪器、材料与试剂

2.1仪器

Agilent1260高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；澳柯玛冰柜（澳柯玛股份有限公司）；XY-FD-50S钟罩式冻干机（上海欣谕仪器有限公司）；超声波清洗器（巩义市予华仪器有限责任公司）；21型可见光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；AV800 MHz核磁共振波谱仪（德国Brucker公司）；Xevo TQ-S超高压液相色谱三重四级杆串联质谱联用仪（英国Waters公司）。

2.2材料与试剂

园蓝成熟果实于2012年8月份在贵州麻江蓝莓种植基地采摘，采摘后于-4℃冰箱中存放；Diaion HP-20大孔吸附树脂（日本三菱树脂株式会社）；200-300目硅胶（青岛谱科分离材料有限公司）；Sephadex LH-20凝胶（GE）；色谱纯甲醇（Hipure Chem）；分析纯85%磷酸（川东化工有限公司）；水为纯净水；其他试剂皆为分析纯。

3方法分析

3.1兔眼蓝莓花青素羟自由基清除率的研究

3.1.1待测液的制备

取一定量的园蓝鲜果用榨汁机匀浆后，以1∶5料液比添加含有3%冰醋酸的甲醇溶液，浸泡1h后，超声提取30min，过滤除去果渣，减压浓缩，得到浸膏。浸膏以Diaion HP-20为固定相，纯水、10%、30%、50%、100%甲醇水和50%丙酮水梯度洗脱，洗脱液经TLC划段，分为10段：Fr.1～10，把这10部分分别配成浓度为1mg/mL和10mg/mL的待测液。

3.1.2羟自由基清除率实验

采用Fenton体系测定个段位（Fr.1～10）对・OH的抑制作用。Fe2+与邻二氮菲能够生成稳定的橙红色络合物在536nm波长有最大吸收峰，A536与络合物的含量存在线性关系，通过计算A536吸收值的变化，得到样品对・OH的清除能力，测定方法见表1。

表1自由基清除率测定方法

溶液用量/mL1样品空白1未损伤1损伤1样品150mmol/L磷酸盐缓冲溶液11111111样品液10.251-1-10.250.75mmol/L邻二氮菲1-1111110.75mmol/L FeSO41-1111110.01%H2O21-1-10.510.5蒸馏水12.510.7510.251-混匀后再37℃水浴60min，取出后立即在536nm 波长处以空白管调零，测定其吸光度

清除率采用下列方法进行计算：

・OH清除率（%） =（A样品-A损伤）÷（A未损-A损伤）×100。

3.2标准品的制备

3.2.1色谱条件

色谱柱4.6×250nm，ZORBAX SB-C18，Agilent；柱温35℃；进样量5 μL；流量1.000mL/min；检测波长520nm；流动相A为1%磷酸水，B为甲醇；洗脱梯度0～25min 20% （B）30% （B）、25～35min 30% （B）45% （B）、35～40min 45%（B）50%（B）。

3.2.2花色苷的分离纯化

对上述浸膏过Diaion HP-20 柱后得到的Fr.10进行分离纯化。以硅胶为固定相，氯仿/甲醇/水为洗脱系统，梯度为8∶2∶0.27∶3∶0.56∶4∶1。通过HPLC分析检测分为Fr.4.1～Fr.4.4。Fr4.4经反复Sephadex LH-20纯化得到化合物1。采用1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS技术鉴定其结构。

3.3总花青素含量的测定

3.3.1待测液的配制

（1）对照品配制。精密称取化合物12200mg于10mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，配制成022mg/mL的标准品溶液，用022μm滤膜过滤备用，标准品的HPLC色谱分析图见图1。

（2）样品液的配制。称取园蓝鲜果2.0000g（Md），碾碎，甲醇超声提取，减压浓缩，得浸膏0.3422g（Mt），精密称取浓缩物0.0541g于10mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，配制成5.4100mg/mL的供试品溶液，供试品溶液的HPLC色谱分析图见图1。

3.3.2标准曲线的绘制

取配制好的对照品溶液，按2.3.1项下的色谱条件进行分析，进样量分别为：1、2、3、4、5、7、10 μL，重复测试3次。以化合物1质量（μg）为横坐标，峰面积平均值为纵坐标作图，进行线性回归分析，计算得线性方程：y=903.19x+0.4347，R2=0.9999，结果表明，标准品化合物1在0.22～2.2μg与峰面积成良好线性关系。

3.3.3精密度实验

取上述标准品溶液，按3.2.1项的色谱条件下进行检测，进样量5 μL，重复进样6次，结果显示峰面积RSD为1.65%。

图1标准品锦葵色素-3-O-葡萄糖（A）、供试品溶

液（B）HPLC色谱图

3.3.4稳定性试验

取鲜果园蓝按3.3.1中（1）段方法制备供试品溶液，室温放置，按上述色谱条件分别于0、2、4、8、12、24h进行检测。结果显示峰面积RSD为1.21%，表明该方法在24 h内稳定性良好。

3.3.5重现性实验

取鲜果园蓝按3.3.1中（2）段方法平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件进行检测，结果6份供试品溶液总峰面积的RSD为0.75%。

3.3.6加样回收实验

精密称取园蓝鲜果浸膏50.4000mg，加标准品溶液5mL于10mL容量瓶中，用分析纯甲醇定容得样品液，平行3份。按上述色谱条件进行检测，结果加样回收率分别为95.42%、94.71%和95.64%，RSD为0.51%。

3.3.7总花青素含量测定

取园蓝鲜果按3.3.1中（2）方法制备供试品溶液，平行3份，按上述色谱条件进检测，根据外标法计算，得到花青素的含量，浸膏中花青素含量计算公式如下：

xt%=Xj1Ct×10-3×Vj×100

式中：xt为提取物浸膏中花青素含量；Xj为供试品溶液5μL进样量中花青素含量（mg）；Ct为供试品溶液浓度（mg/mL）；Vj为供试品溶液的进样量（μL）。

冻干果中花青素含量计算公式如下：

xi%=xt×Mt1Md。

式中：xi为园蓝鲜果中花青素含量；Mt为园蓝鲜果提取物浸膏的质量（g）；Md为园蓝鲜果的质量（g）。

4结果分析

4.1抗氧化作用

Diaion HP-20划段后各Fraction的抗氧化活性如图2所示，可知在高浓度下（10mg/mL）除Fr.1（糖）和Fr.8（紫色未知）活性较低外，其他各部分均有较好的抗氧化活性；但是低浓度（1mg/mL）除Fr.10的抗氧化活性与Vc的抗氧化活性相当，其余部分的抗氧化活性明显降低，而其中有520nm特征吸收峰的为Fr.10，说明Fr.10为含花青素段。实验说明，高、低浓度下花青素部分均有良好的抗氧化活性，且低浓度时的抗氧化活性与等浓度的维生素C的活性相当。

2014年11月绿色科技第11期4.2化合物1结构鉴定

化合物1为紫色粉末，易溶于甲醇，ESI-MS：m/z 493[M+]，碎片离子峰331，通过核磁共振谱图数据分析，化合物1的化学结构确定为锦葵色素-3-O-葡萄糖（malvidin 3-O-glucoside）[8]。经HPLC峰面积归一化法测得其含量96%。

化合物1的波谱数据：1H-NMR （800 MHz，CD3OD）：9.062 （s，H-4）、8.017（s，H-2′，6′）、7.001（d，J = 0.8 Hz，H-8）、6.691（d，J=1.6Hz，H-6）、4.028（s，2 x-CH3）、5.378（d，J=8Hz，H-1″）、3.670（t，J=8Hz，H-2″）、3.579（t，J=8.8Hz，H-3″）、3.438（t，J=8.8Hz，H-4″）、3.942（q，J=2.4Hz，H-5″）、4.315（m，H-6″a）、4.090（m，H-6″b）；C13-DEPT（200 MHz，CD3OD）：162.59（C-2，q）、144.4（C-3，q）、135.72（C-4，t）、157.92（C-5，q）、102.46（C-6，d）、169.29（C-7，q）、93.96（C-8，d）、156.53（C-9，q）、112.25（C-10，q）、118.45（C-1′，q）、109.24（C-2′、C-6′，t）、148.35（C-3′、C-5′，q）、144.80（C-4′，q）、55.88（-CH3）、55.87（-CH3）、101.93（C-1″，t）、73.63（C-2″，t）、77.54（C-3″，t）、69.80（C-4″，t）、76.82（C-5″，t）、60.99（C-6″，d）。

图2高、低浓度下各段的抗氧化活性

4.3总花青素含量

从表2中可知，园蓝鲜果甲醇提取物浸膏中花青素的百分含量为3669%，鲜果中总花青素平均含量为6277mg/100g。用相同的方法测得园蓝冻干果中总花青素含量为4709g/100g。园蓝鲜果花色苷中化合物1含量最高为1268mg/100g。

5结语

园蓝提取物具有较强的抗氧化活性：非花青素部分在高浓度的情况下具有较好的抗氧化活性，而花青素部分在低浓度的情况下就能达到与高浓度时相当的抗氧化活性，且与Vc的清除自由基的能力相当，都说明园蓝花青素具有很好的抗氧化活性。同时实验还表明园蓝花青素中，主成分为锦葵色素-3-O-葡萄糖。对其花青素含量进行测定，不仅能为花青素的综合利用提供理论依据和数据支持，还可以指导人们对蓝莓花青素的日常使用，据报道每人每天摄入花青素量约为12.5mg[9]，以此推算如果是食用以上的品种的蓝莓鲜果，每人每天食用约2g园蓝鲜果即可满足摄入花青素的要求。

表2园蓝鲜果花青素含量分析表

样品编号1Xj/（×10～4mg）1xt%1xi%119.94313.67610.6290219.90413.66110.6264319.92413.66910.6277花青素平均含量19.92413.66910.6277

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