冰灯玉露松散型胚性愈伤组织的诱导方法
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摘 要：为了获得冰灯玉露松散型胚性愈伤组织，采用冰灯玉露组培苗叶片为外植体，在含有不同激素的培养基上，通过不同的继代培养，从中找到诱导出松散型胚性愈伤组织的最适条件。结果显示，在1/2 MS+2 mg・L-1 2，4-D+20 g・L-1蔗糖的培养基上可以诱导出松软的愈伤组织。再将这些松软的愈伤组织转接到MS+1 mg・L-1 BA+0.5 mg・L-1 2，4-D+30 g・L-1蔗糖的培养基上，经过3～5次继代培养，继代培养时选择质地较硬、结构松散的愈伤组织进行转移，最终获得结构松散的愈伤组织。再将这些松散型愈伤组织在MS+2 mg・L-1 BA+0.5 mg・L-1 2，4-D+30 g・L-1蔗糖的培养基上^续培养，经过2～3次继代培养即可获得冰灯玉露松散型胚性愈伤组织。该试验结果可为冰灯玉露离体诱变育种及其相关的科学研究提供良好的试材。
关键词：冰灯玉露；松散型胚性愈伤组织；继代培养；培养基
中图分类号：S382.36 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.07.006
Induction Method of Loose Embryogenic Callus of Haworthia cooperivar
YAN Xiaofeng，LIU Yanjun，HUANG Junxuan，YANG Jinghui，LI Jianke，WU Chunxia
（College of Horticulture and Landscape Architecture， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China）
Abstract： In order to obtain the loose embryogenic callus of Haworthia cooperivar， the optimal conditions for the induction of loosely embryogenic callus were found by using the leaf explants of tissue culture plantlet in the medium containing different hormones and through different subculture. The results showed that soft callus could be induced on 1/2 MS+2 mg・L-1 2，4-D+20 g・L-1 sucrose medium. The callus was transferred to MS+1 mg・L-1 BA+0.5 mg・L-1 2，4-D+30 g・L-1 sucrose medium， and the callus was transferred after 3 to 5 times of subculture， and the loose callus was obtained after subculture. These calluses were cultured on the medium of MS+2 mg・L-1 BA+0.5 mg・L-1 2，4-D+30 g・L-1 sucrose， and the loose embryogenic callus of Haworthia cooperivar was obtained through 2～3 subculture. The results of this study provide good experimental materials for the mutagenic breeding of Haworthia cooperivar and its related scientific research.
Key words： Haworthia cooperivar； loosely embryogenic callus； subculture； medium
冰灯玉露（Haworthia cooperivar）属于百合科十二卷属的多年生肉质草本植物，具有很高的观赏价值。近年来，多肉植物越来越受到广大花卉爱好者的青睐。一些花卉栽培者广泛收集各种玉露品种，并通过杂交育种手段培育出各式各样的新品种，以满足市场的需求[1-3]。常规育种由于受到种质资源的限制，一些新的性状很难通过杂交的方法获得。诱变育种是一种简便易行且能够获得许多新鲜性状的育种手段。在诱变育种中，采用体细胞离体诱变技术是目前较为流行的育种新方法，在许多植物上已获得应用。在离体诱变育种中，最有优势的材料是胚性愈伤组织，因此，获得胚性愈伤组织是进行体细胞诱变育种的关键[4-8]。
多肉植物的再生一般通过原球茎的途径进行，在适当激素的作用下，在外植体的伤口部位会形成球形结构的愈伤组织。这些组织一般为淡绿色、结构紧密的愈伤组织类型，这种球形愈伤组织在没有激素或少量分裂素的培养基上可以形成不定芽，对这些不定芽继续培养就可以获得再生植株，从而建立完整的离体再生体系[9-15]。但采用胚性愈伤组织再生一般不容易实现，其主要原因是形成的愈伤组织一般结构都很紧密，极易通过器官发生的途径形成原球茎。为此，本试验的目的就是诱导冰灯玉露产生胚性愈伤组织，通过胚状体发生的途径进行离体再生。本试验的结果可以为冰灯玉露离体诱变育种及其相关的科学研究提供良好的试材。
1 材料和方法
1.1 材 料
本试验中所用冰灯玉露组培苗来源于天津农学院园林植物实验室。
1.2 方 法
1.2.1 松软性愈伤组织的诱导 将冰灯玉露组培苗在超净台中将叶片剪下，注意不要将叶片的尖端造成伤口，仅留叶柄一段有伤口。将叶片接种到事先配制好的含有不同激素和不同渗透压的MS培养基上，在培养室中进行培养，主要目的是诱导叶片伤口部位产生松软型愈伤组织。培养条件为25 ℃、1 000 lx光照强度下连续光照。试验所用容器为100 mL三角瓶，内装30 mL培养基。每个三角瓶中接种5块叶片，每个处理做8个瓶重复。接种上叶片后，每天对其进行观察，经过30 d培养，对愈伤组织诱导情况进行记录与统计，找到适宜的培养基配方。
1.2.2 松散型愈伤组织的诱导 将上一步骤中诱导出的冰灯玉露松软型愈伤组织，转移到事先配制好的含有不同激素的MS培养基上，目的是进行松散型愈伤组织的诱导。试验在每个三角瓶中接种10块愈伤组织，每个处理做5个瓶重复。培养条件为22 ℃、2 000 lx光照强度下连续光照。培养14 d为一次继代时间，继代时选择结构松散、质地较硬的愈伤组织进行选择性转移，同时将稀软、褐变的愈伤组织淘汰。经过3次继代培养，对愈伤组织诱导情况进行记录与统计，找到诱导松散型愈伤组织的最佳培养基配方。
1.2.3 松散型胚性愈伤组织的诱导 经过松散型愈伤组织的诱导，将结构松散、质地较硬的愈伤组织作为外植体，转接到新的培养基上进行松散型胚性愈伤组织的诱导。培养基中加入不同浓度的激素配比，试验设计与上一步骤相同。培养条件为23 ℃、3 000 lx光照强度下连续光照。培养20 d为一次继代时间，继代时选择结构松散、质地较硬、颜色淡绿、表面有球形结构的愈伤组织进行选择性转移，同时将松软、白色、褐变的愈伤组织淘汰。经过3～5次继代培养，结合显微观察，根据愈伤组织诱导结果，找到诱导冰灯玉露松散型胚性愈伤组织的最佳培养基配方。
2 结果与分析
2.1 松软型冰灯玉露愈伤组织诱导结果
将冰灯玉露叶片接种到诱导培养基表面，经过3～5 d培养，叶片开始膨大，有些处理伤口出现少量愈伤组织。经过大约30 d的培养，每个处理诱导的情况各不一样，具体情况见表1。
从表1可以看出，在所用培养基上都可以诱导出愈伤组织。从2，4-D的浓度来看，1 mg・L-1的诱导效果比2 mg・L-1要差一些，说明较高浓度2，4-D更容易诱导出愈伤组织。本试验曾尝试4 mg・L-1的2，4-D，但诱导效果不如2 mg・L-1。从渗透压来看，低渗透压也利于愈伤组织的诱导，1/2MS明显好于MS，20 g・L-1蔗糖要好于30 g・L-1蔗糖。从诱导出的愈伤组织质地和生长速度来看，低渗透压诱导出的愈伤组织质地松软、生长速度明显较快，相反，高渗透压诱导出的质地较硬，生长速度较慢，这类愈伤组织继续培养很容易诱导出原球茎，但这是本试验不想诱导出的愈伤组织类型。因此，最后采用1/2 MS+2 mg・L-12，4-D+20 g・L-1蔗糖的培养基作为冰灯玉露松软型愈伤组织的诱导配方。
2.2 松散型冰灯玉露愈伤组织诱导结果
将上一步骤诱导出的松软型愈伤组织转移到新的培养基上进行松散型愈伤组织的诱导。由于愈伤组织比较松软，因此，在进行愈伤组织转移过程中应小心夹取，尽可能保持较大块的愈伤组织被转移，因为愈伤组织块过小在转移培养的初期会很容易死亡，导致无法进行下一步试验。愈伤组织初次继代时多数培养基上的变化仍然较小，经过2次继代和继代时的有目的的取舍，在不同培养基上愈伤组织会出现明显的差异，具体情况见表2。
从表2可以看出，不同激素组合对冰灯玉露愈伤组织生长的影响差异显著。首先，单独使用BA或2，4-D时愈伤组织生长缓慢并且一直保持松软状态，随着培养时间的延长，愈伤组织基本都死亡，这说明，松软愈伤组织如果不在BA和2，4-D共同作用下很难转变成质地松散的愈伤组织。其次，采用较低浓度BA并在适当浓度2，4-D的作用下，松软愈伤组织基本可以转变为松散型愈伤组织，而且生长速度较快，而在较高浓度BA（2 mg・L-1）时，即使改变2，4-D的浓度愈伤组织也很难转变为松软的愈伤组织，而且愈伤组织基本死亡，即使存活一些，这些愈伤组织最终都会发展成为紧密型的绿色愈伤组织，而不是试验所需要的松散型愈伤组织。所以，综合以上愈伤组织生长情况，选择MS+1 mg・L-1BA+0.5 mg・L-12，4-D+30 g・L-1蔗糖的培养基进行愈伤组织的培养，经过3～5次继代培养，继代培养时选择质地较硬、结构松散的愈伤组织进行转移，最终获得结构松散的愈伤组织。
2.3 冰灯玉露松散型胚性愈伤组织诱导结果
将上一步骤诱导出的冰灯玉露松散型愈伤组织转移到含有不同激素的MS培养基上，进行松散型胚性愈伤组织的诱导。经过几次继代培养，愈伤组织逐渐出现结构与生长的变化，在不同培养基上的表现不同，具体情况见表3。
从表3可以看出，不同激素配比对于冰灯玉露松散型胚性愈伤组织的形成影响较大。首先，在2，4-D浓度不变，且处于低浓度（0.5 mg・L-1）时，随着BA浓度的增加愈伤组织质地从松散型向紧密型转变，颜色也从白色过渡到绿色，生长速度和胚性化的变化主要依赖于BA/2，4-D的比值，当BA为2 mg・L-1，2，4-D为0.5 mg・L-1时，愈伤组织生长速度最快，愈伤组织胚性化程度最高。其次，在较低浓度BA，不同浓度2，4-D作用下，愈伤组织虽然都为松散型愈伤组织，但其胚性化程度不高，只在0.5 mg・L-1BA+0.5 mg・L-12，4-D激素配比时才有部分愈伤组织出现胚性化。因此，综上结果，将冰灯玉露松散型愈伤组织转移到MS+2 mg・L-1BA+0.5 mg・L-12，4-D+30 g・L-1蔗糖的培B基上继续培养，经过2～3次继代培养即可获得冰灯玉露松散型胚性愈伤组织。
3 结论与讨论
本试验的目的是诱导松散型胚性愈伤组织，但在诱导初期首先进行了松软型愈伤组织的诱导，其主要原因是结构松散的愈伤组织细胞之间联系较少。在愈伤组织初步诱导时，如果是结构紧密型的愈伤组织，组织细胞之间联系紧密，随着细胞分裂与生长，细胞间的空隙会越来越少，这样就不能形成结构松散的愈伤组织。但初步诱导出松软的愈伤组织后，这些组织主要由两种细胞组成，一是巨大型细胞，这种细胞比正常细胞大几倍或几十倍，液泡巨大，几乎没有细胞质，并且不能分裂，这类细胞一般是成熟细胞吸水膨大形成的，随着培养时间的延长细胞解体死亡；另一种是细胞较小，细胞质浓，分裂旺盛，这类细胞主要由分生组织细胞发育而来。以上两种细胞的比例决定着愈伤组织的质地，一般巨大型细胞较多时，愈伤组织为松软或稀软型，而小的细胞多时，愈伤组织质地会相对紧密，随着进一步的培养大细胞死亡，这会造成小细胞之间出现一定数量的空隙，从而导致细胞之间的联系分散，容易诱导出松散型的愈伤组织。因此，本试验在诱导冰灯玉露松散型胚性愈伤组织之前先进行松软型愈伤组织的诱导。
本试验通过一系列试验，最终获得了冰灯玉露松散型胚性愈伤组织。具体步骤为先以冰灯玉露组培苗叶片为外植体，在1/2 MS+2 mg・L-12，4-D+20 g・L-1蔗糖的培养基上诱导出松软的愈伤组织。然后将这些松软的愈伤组织转接到MS+1 mg・L-1 BA+0.5 mg・L-12，4-D+30 g・L-1蔗糖的培养基上，经过3～5次继代培养，继代培养时选择质地较硬、结构松散的愈伤组织进行转移，最终获得结构松散的愈伤组织。再将这些松散型愈伤组织在MS+2 mg・L-1BA+0.5 mg・L-12，4-D+30 g・L-1蔗糖的培养基上继续培养，经过2～3次继代培养即可获得冰灯玉露松散型胚性愈伤组织。这种愈伤组织在MS培养基上可以发育成球形胚，继而发育成完整的胚状体，并最终成苗。
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