生物芯片与临床应用
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摘 要生物芯片技术是近几年来发展起来的一种高通量、快速和高度并行性、微量化和自动化等特点的分析技术。目前已成为研究生命本质及疾病发生发展规律的重要手段。本文对生物芯片技术的基本概念、分类、特点、基本原理及其在部分疾病研究中的应用进行回顾。
关键词生物芯片技术;临床应用
AbstractThe chip biotechnology is the microanalysis and automation analytic method and has high flux level and quick parallelism year by years.It has become an important means of life and a tool to study disease at present.The paper was written to review the use of the technology for diagnosis of diseases.
Key wordsThe chip biotechnology;clinical
生物芯片(Biochip)SL称微阵列(Microarray)技术,是近年来生命科学与微电子学等学科相互交叉发展起来的一门高新技术,是随着人类基因组计划(HGP)的研究发展应运而生。90年代初,Fodor等发明了一种利用光刻技术在固相支持物上光导合成多肽的方法,并在此基础上于1993年设计了一种寡核苷酸生物芯片;1996年世界上第一块商品化的生物芯片问世。仅十余年,生物芯片技术在临床病原菌、毒力基因、抗药性基因、致病因子的快速检测等方面已取得了突破性进展,除此之外,该技术还应用于新药开发,食品与环境监督等众多领域而且提供了强有力的技术支持。生物芯片技术已日益成熟和完善,显示出诱人的应用前景。
1生物芯片技术的概述
1.1生物芯片技术原理
生物芯片技术的基本原理是分子杂交。类似于Southern和Northern印迹杂交技术。具体来讲,就是通过微加工工艺将大量生物识别分子,如核酸片段、多肽分子、甚至组织切片、细胞等[1-4]按照预先设置的排列方式 固定在厘米见方的芯片片基(基质或载体)上,利用生物分子之间特异性亲和反应,实现对基因、配体、抗原等生物活性物质的检测分析。
1.2根据探针分子种类划分
基因芯片(又称DNA芯片,DNA阵列,DNA微阵列,寡核苷酸阵列等) 探针分子为单链基因级DNA或mRNA反转录的cDNA,这种探针分子一般为某种病原体或组织所特有的。其具有稳定、点密度较高、探针分子对疾病的针对性强等特点[5-7]。
寡聚核苷酸芯片探针分子为寡聚核苷酸,主要用于病原体的分类、基因的突变检测。
肽、蛋白芯片 探针分子为多肽或蛋白包括酶、抗体、受体等。该方法不仅适用于抗原、抗体的筛选,同样也适用于受体配体的相互作用的研究。但其稳定性、重复性问题较突出[8-9]。
1.3根据支持介质划分
传统杂交分析技术以硝酸纤维素膜或尼龙膜为载体,杂交反应后经放射性自显影、生物素或地高新等方法进行检测。由于硝酸纤维素膜或尼龙膜等材料有渗透作用,易使被分析的材料扩散,因此生物芯片分析利用固相表面作为载体。固相表面无渗透渗透作用,少量的生化物质可准确地沉淀特定位置上;同时固相片基能够提供一个均匀的接触面,可以提高定量分析的质量。制作生物芯片的载体材料很多,大致可分为4类:无机材料、天然有机聚合物、人工合成的有机高分子聚合物和各种高分子聚合物制成的膜。目前,适用于制作生物芯片的载体材料只有少数几种,如:玻璃片、金属片、各种有机高分子制作的薄膜等。生物芯片按载体可分为:硅晶片芯片、玻璃芯片、塑料芯片和磁珠芯片等[10]。
1.4根据制备方法划分芯片制备的方法有“原位合成”和“合成点样”两种方法
原位合成指直接在芯片上用4种核苷酸合成所需探针的基因芯片制备技术,主要包括:原位光刻合成、原位喷印合成、分子印章多次压印合成。合成点样是指将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人直接点在芯片片基上。主要包括:微型机械点样法、化学喷射法[11]。
2生物芯片技术在临床疾病诊断中的应用
2.1生物芯片技术在病原体检测中的应用
生物芯片在病毒检测中应用较为广泛。目前,全球每年艾滋病感染者急剧增加,80%集中在发展中国家。生物芯片在HIV检测及相关研究中发挥了一定的作用。1996年底Kozal等研制了一种DNA芯片,对HIV-1逆转录酶及蛋白酶基因突变进行筛查,他们提取了102个病人HIV-1的RNA,利用高密度寡核苷酸阵列进行测序,发现了167种序列。其后,Mfymetrix公司和Roche Molecular公司合作生产的新一代诊断试剂盒,利用RMS实验室的PCR扩增技术和DNA芯片技术结合检测艾滋病病人的HIV耐药反应。HIVPRT440也已广泛用于HIV-1病毒的测序、分型及多态性分析[12]。
生物芯片技术也能对所有肝炎病毒的分型、变异、突变和病毒核酸含量进行高通量、平行检测。该方法不仅简便易行,而且实验成本大为降低,为临床的准确诊断、合理用药、判定预后提供确实可靠的实验数据[13]。如对抗-HCV IgG进行c区,NS3、NS4、NS5不同区域检测和甲～庚型肝炎病毒的检测。Zhu等利用DNA芯片对人巨细胞病毒(HCMV)感染宿主引起的细胞基因表达改变进行了全面分析[14]。对约6600个人mRNA的表达进行监测,结果感染前后258种mRNA水平改变4倍以上,其中一些mRNA编码的基因产物在病毒致病性中起关键作用,值得进一步研究。生物芯片同样用于细菌检测中。1998年底,Troesch等[15]开始研制一种DNA芯片,针对分枝杆菌属感染的病人进行检测,部分病人对利福平产生耐药,设计研制此种DNA芯片可对耐药机制有进一步了解。De Saizieu等[16]用64OO0个寡核苷酸阵列来检测100个肺炎双球菌的基因,其敏感性比Northern印迹要好一些。他们测量了肺炎球菌在指数生长和静止期的基因表达差异。例如在静止期,多糖荚膜合成、长链脂肪酸合成、细胞分裂相关的酶的表达水平极低,这些与预期结果一致。
2.2在癌症方面的应用研究
由于肿瘤是对人类健康威胁最大的疾病之一,而且目前尚无有效的治疗方法,所以很多学者期望能够对肿瘤进行快速鉴定和分类,从而为早期诊断和治疗创造条件。生物芯片目前是一种广泛用于检测癌症的强大工具,并且可以基于共同的分子特征和临床表现有效区分癌症的亚型。斯坦福大学的Uma[17]是第一个使用DNA芯片研究包括癌症在内的多种疾病基因表达特征的人。乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤,全世界每年约有120万妇女发生乳腺癌,它对病人的健康和生命造成严重的威胁。维生素D受体(VitamiD Receptor,VDR)是维生素D通路上的重要调节因素,与乳腺癌发病有密切关系。Trabert[18]通过对人群进行病例一对照研究,进而发现VDR基因3'端的多态性(特别是BsmI和Poly A)和乳腺癌危险因素之间的关系,去除混杂因素后,结果表明,高加索人群中,绝经后女性的BsmI基因的bb基因型是乳腺癌发病的显著性危险因素(OR=1.53)。
急性淋巴性白血病是以母细胞失调和分化为特征的快速进展型白血病。Notch基因家族成员Notch在T细胞急性淋巴性白血病(T-cell acutelymphoblastic leukemia,T-ALL)发生中扮演着重要的角色,大约50%～60% 的T-ALL病人中都存在该基因的突变,使其成为T-ALL中最常见的活化癌基因[19]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantarget of rapamycin,mTOR)的通路异常与遗传病、肿瘤等有关。在T-ALL细胞中,Notch可以调节mTOR通路的活性[20]。Steven[19]通过蛋白芯片技术研究13种人类T细胞白血病细胞株中,82种信号蛋白中的108抗原决定簇蛋白的磷酸化状态,结果表明,如果用小分子抑制剂同时阻断mTOR和Notch的通路可以协同抑制T-ALL的发展。
这种药物联合作用可能成为治疗“基于Notch肿瘤”的一种新型治疗方法。对于恶性肿瘤的早期发现、早期诊断和早期治疗是肿瘤患者获得长期生存的主要途径。肿瘤标志物的检测对于肿瘤的早期诊断,以及亚健康人群普查有很大价值。王江涛[21]采用蛋白芯片进行多种肿瘤标志物的检测,可同时检测肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等12种常见肿瘤标志物。结果表明,通过蛋白芯片的检测结果与临床诊断基本吻合,从而充分说明多肿瘤标志物蛋白芯片在肿瘤的临床诊断中有较好的应用价值。
2.3 对自身免疫性疾病的应用研究
自身免疫性疾病是指由机体自身产生的抗体或致敏淋巴细胞破坏、损伤自身的组织和细胞成分,导致组织损害和器官功能障碍的原发性免疫性疾病。很多自身免疫性疾病以检测到特异性抗体为诊断依据,例如:系统性红斑狼疮中的抗双链DNA抗体和抗Smith抗体;多结缔组织疾病中的抗U1-snRNP抗体;Graves病中的抗甲状腺刺激激素受体抗体等。采用蛋白芯片可以在一张芯片上同时检测上百种自身抗体,对于初筛自身免疫性疾病具有很大价值[22]。
自身抗体的检测不仅可以提供诊断信息,还可以提示预后信息。例如系统性红斑狼疮中的抗双链DNA抗体和活动性肾炎有关;抗R0抗体和皮肤狼疮、光敏性皮炎及新生儿狼疮综合征等有关。临床医生可以根据这些信息预测病人的预后。Robinson实验室目前开发出了多种疾病特异性抗原蛋白芯片,其中包括多结缔组织疾病检测芯片(含来自多种风湿病人的200多种自身抗原);滑膜蛋白检测芯片,其中包括650种以上的自身抗原;髓磷脂蛋白检测芯片,其中包括500种以上的髓磷脂蛋白等[23]。
多发性硬化症是一种慢性神经脱髓鞘性疾病,最终会导致神经轴突的损伤。可以识别髓磷脂抗原的免疫细胞和抗体(例如伽玛干扰素、IL-17等)与发病有关。尚无公认的治疗方法,目前治疗的重点在于抑制或者耐受患者的抗原特异性自身免疫反应,可以通过编码一种或多种髓磷脂抗原的质粒DNA疫苗达到上述目的。Bar[24]研制了一种可以编码人类髓磷脂基础蛋白全长的,名为BHT-300的DNA疫苗,治疗了复发性和继发进行性多发性硬化症的3O个病人。结果表明,BHT-3009安全、药物反应易于被患者接受,并且可以有效改善患者的脑部核磁共振扫描结果。
2.4对遗传疾病的应用研究
老年黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)是一种可遗传的视网膜退化病变,患者的黄斑点退化导致中央视觉受损,已成为老年人重要的致盲性眼病之一[25]。Haines[26]通过基因芯片技术,对2个独立的数据集(162个核心家庭关联数据集和399例病人、159例对照组成的病例一对照数据集)发现基因LRP6、基因VEGF和基因VLD.LR是产生AMD的危险因素。Leber遗传性视神经病变(Leber S hereditary opticneuropathy,LHON)是第一个被鉴定出与线粒体DNA点突变有关的母系遗传性致盲性视神经疾病。临床上以两侧连续急性或亚急性中央视力衰退为特征,主要累及男性青少年[27]。Danielson[28]通过基因芯片技术研究了LHON线粒体的基因表达变化,结果表明,醛糖还原酶在LHON的转线粒体细胞中具有较高的表达水平。醛糖还原酶的产物之一是山梨醇,此物质与视神经病变有关,而且在LHON转线粒体细胞中,山梨醇的水平较高。因此,初步推断醛糖还原酶抑制剂对LHON有一定治疗作用。
3结束语
生物芯片技术诞生至今已有十几年的历史了,其发展具有三个主要特点:①生物芯片的品种繁多,目前用于检测生物组分的技术如杂交、电泳、质普分析、荧光染色等,均被用于生物芯片技术的开发和应用,使得生物芯片技术呈现百花齐放,百家争鸣的格局;②生物芯片的发展方向是微缩芯片实验室,尽管生物芯片的种类繁多,各有优点。但各种芯片的最终发展目标是将样品制备和检测微缩成一体,即微缩芯片实验室;③生物芯片技术由实验研究走向临床应用,AtheNA Multi-Lyre芯片通过FDA 认证是生物芯片从实验室进入临床应用的标志。随着新材料、新技术的不断开发,生物芯片技术将得到进一步的完善和发展。相信不久的将来,包含所有步骤的缩微芯片实验室将不断涌现。
尽管生物芯片技术从产生到现在已显示出巨大的优势,发挥了一定潜力。但其技术仍有一些亟待解决的问题,如:① 提高生物芯片的特异性;② 简化样本制备和标记操作;③ 增加信号检测的灵敏度;④高度集成化样本制备、基因扩增、核酸标记及检测仪器的研制和开发等。但它的出现必将在人类疾病的诊断中发挥巨大的作用。可以预测,生物芯片技术带来了检测分析领域的一场革命。
参考文献
[1] Mucci NR,Akdas G,Manely S,et a1.Neurodocrine expression in metastatic heterogeneous protein expression[J].Human Pathol,2000,31(4):406～414.
[2] NocitoA,Bubendorf L,MariaTE,et a1.Microarray of bladder cancer tissue are highly representative of proliferation index an d histological grade[J].J Pathol,2001,194(3):349-357.
[3] 郭志儒.一种新型的生物芯片-活细胞芯片[J].中国兽医学报,2002,22:21.
[4] 叶军平、易慕华.生物芯片技术与病理学发展[J].中国新医药,2004,3(4):87～88.
[5] Steintrucke P,AldingerU,HillO,et a1.Design of helical proteins for real-time endopropease assays[J].Anal Biochem,2000,286(1):26～34.
[6] Hernalz M,Liu J,Rosenberg RD,et a1.Enzymatic modification of hepara sulfate on a biochip promotes its interaction with antithrombin[J].Bioehem Biophys Res Commun,2000,276(1):292-297.
[7] Check W.Upping the ante in biochip research[J].CAP Today,2000,14(3):50～54.
[8] Boguski MS,Mcintosh MW.Biomedical informatics for proteomics[J].Nature,2003,422(6928):233～237.
[9] Weinberger SR,Morris TS,Pawlak M.Recent trends in protein bio-chip technology[J].Pharmacogenomics,2000,1(4):395～416.
[10] 张立勇、张学工、李衍达.生物芯片技术[J].世界华人消化杂志,2004,12(4):955-958.
[11] 府伟灵、黄庆.基因芯片在临床疾病诊断中的应用[J].国外医学-生物化学与检验学分册,2002,23(1):3～5.
[12] Vahey M,Nan ME,Barrick S,et a1.Performance of the affymetrix genechip PRT440 platform for antiretroviral drug resistence genotyping of human immunodeficiency virus type 1 clades an d viral isolates with length polymporphisms[J].J Clin Microbiol,1999,37(8):2533～2537.
[13] 冷彦宁.基因芯片技术与检验医学[J].国外医学-临床生物化学与检验学分册,2002,23(1):21～23.
[14] 李慧卿.生物芯片在病原体检测中的应用[J].国外医学-生物化学与检验学分册,2002,23(1):12.
[15] Toeseh AJ,Varadi A,Rasko I,et a1.Myeobaterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays[J].J Clin Microbiol,1999,37(1):49～55.
[16] De Saizieu A,Certa U,Warrington J,et a1.Bacterial transcript imaging by hybridization of total RNA to oligonucleotide arrays[J].Nature Biotechnol,1998,16(1):45～48.
[17] Uma RS.DNA microarray and breast cancer-a review[J].Int J Hum Genet,2007,7(1):49～56.
[18] Trabert B.Vitamin D receptor polymorphisms and breast cancer risk in a large population- based case control study of Caucasian and African-American women[J].Breast Cancer Res,2007,84(9):3～4.
[19] Steven M. Notch signals positively regulate activity of the mtor pathway in T-cell acute lymphoblastic leukemia[J].Lood,2007,110:278～286.
[20] 郑杰.mTOR信号途径与肿瘤[J].生命科学,2006,18(3):261～265.
[21] 王江涛.多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统在临床中的诊断价值[J].中华医学研究杂志,2006,6(9):978～980.
[22] Balboni I.Multiplexed protein array platforms for analysis of autoimmune diseases[J].Immunol,2006,24:391～418.
[23] Bar A.Induction of antigen-specific tolerance in multiple sclerosis after immunization with DNA encoding myelin basic protein in a randomized,Placebo-Controlled Phase 1/2 Trial[J].Arch Neurol,2007,64(10):E1-E2.
[24] Conley YC.CFH,ELOVIA,PLEKHA1 and LOC~87715 genes and susceptibility to age-related maculopathy:AREDS and CHS cohorts and meta-analyses[J].Hum Mol Genet,2006,15(21):3206～3218.
[25] Haines J L.Functional candidate genes in age-related macular degeneration:significant association with VEGF,VLDLR,and LRP6[J].Inves Ophthalmol,2006,47(1):329-335.
[26] 陈刚.线粒体DNA突变与相关人类疾病[J].Hereditas,2007,29(11):1299～1308.
[27] Danielson SR.Isolation of transcriptomal changes attributable to LHON mutations and the cybridization process[J].Brain,2005,128:1026～1037.
作者简介:
沈 瑜女(1979-6),籍贯:上海市,大学本科,住院医师 。