正交设计法优化两头尖总皂苷微波提取工艺

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（山西中医学院，山西 太原 030024）

摘 要：目的:优选两头尖总皂苷的最佳提取方法和提取工艺。方法:以两头尖中总皂苷的提取率为指标,考察回流法、超声法、微波法提取两头尖总皂苷的优劣,并采用正交设计法优选两头尖总皂苷微波提取工艺。结果：两头尖总皂苷的最佳提取工艺为，使用60%乙醇，10倍量，微波提取8min。结论：微波提取两头尖工艺简便、经济、合理，此工艺条件可行。

关键词：两头尖；总皂苷；正交试验；微波提取

中图分类号：R284.2文献标识码：A文章编号：1673-7717（2011）03-0553-03

Orthogonal Experiments for Pptimizing the Microwave Extracting Conditions of

Liangtoujian Total Saponins

LI Hui-fang,LI Xiao-bo,YAN Jing-hua,MEN Jiu-zhang

（Shanxi College of TCM,Taiyuan 030024,Shanxi,China）

Abstract:Objective：To study and select the optimal extracting technique of Liangtoujian total saponin.Method：Regarding the content of total saponins in liangtoujian as the index of investigation, the methods such as the circumfluence exaraction, ultrasonic exaraction and microwave exaraction as affecting the content of total saponins were studied.To compare three extracting methods for the Liangtoujian total saponin，and select the optimal microwave extracting technique by the orthogonal design method.Results： The optimal extracting technique of Liangtoujian total saponin was that 60% alcohol was used and the volume of solvent was 10 times as much as that of the amount of crude drug，the reflux time was 8 minutes.Conclusion：The microwave extraction process was simple, feasible, economical and reasonable, deserved popularizing all the more.

Key words:Liangtoujian；saponins；orthogonal test；microwave exaraction

收稿日期：2010-10-30

基金项目：山西省自然基金资助项目（2008011073-2）

作者简介：李会芳（1980-），女，山西晋城人，讲师，博士，研究方向：中药药效物质基础筛选。

通讯作者：门九章（1963-），男，山西大同人，教授，博士，研究方向：中西医结合基础。

两头尖系毛莨科银莲花属植物多被银莲花（Anemone raddeana Rege1）的干燥根茎，分布于我国东北及山东等地。其味辛性热，具有祛风湿、消痈肿之功效可用于治疗风寒湿痹、四肢拘挛、骨节疼痛、痈肿溃烂等疾病。其中所含两头尖总皂苷具有抗肿瘤、消炎、镇痛、抗惊厥及抑菌作用［1］。

微波技术的应用,近年来得到很大发展。微波具有穿透力强、选择性高、加热效率高等特点。微波辐射可以大幅度提高提取速度,缩短提取时间。微波技术应用于植物细胞破壁,有效地提高了收率。采用微波提取法提取两头尖总皂苷尚未见报道，本实验在通过对不同提取方法的考察的基础上，采用微波技术，利用正交设计优化两头尖总皂苷最佳提取条件，为两头尖总皂苷的研究和开发利用奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

紫外分光光度计（VIS-723G型）,为北京瑞利分析仪器公司产品；微量电子天平（万分之一）,为上海精密科学仪器有限公司产品；电子恒温水浴箱（HH-2A型）为北京科伟永兴仪器有限公司产品；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9075A型），为上海一恒科学仪器有限公司产品；超声波清洗器（KQ3200E型），昆山市超声仪器有限公司产品；美的微波炉（KD25B-C型），美的集团产品。

1.2 试剂与药材

两头尖药材：中国亳州市京皖中药饮片厂（GMP认证号：皖G0138），经本院中药鉴定教研室裴香萍老师鉴定；竹节香附素A对照品（批号：111721-200501）：中国药品生物制品检定所；甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、高氯酸、香草醛等试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 两头尖总皂苷含量测定

2.1.1 标准曲线的绘制 称取干燥至恒重的两头尖总皂苷对照品10.2 mg ,加入甲醇超声溶解,定容至10mL,制成对照品溶液。取适量对照品溶液进行显色反应, 用723-G可见分光光度计在420～620 nm范围内扫描,在545 nm处有最大吸收, 确定λmax545nm为测定波长。精密称取竹节香附素A标准品10.2mg，用甲醇定容于10mL容量瓶中，用微量进样器分别吸取60、80、100、120、140、160μL于10mL具塞试管中，另准备一10mL具塞试管作为随行空白，60℃水浴挥干甲醇，依次加入0.05g/mL香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8mL，摇匀，置70℃水浴15min，立即取出，冰水浴1min，加乙酸乙酯5mL稀释，放置。定波长545nm测定吸光度。经线性回归处理，得回归方程为Y0.1918X+0.0159，R20.996。

2.1.2 供试品中两头尖总皂苷含量的测定 将正交实验提取的各样品用甲醇定容于25 mL容量瓶中，作为供试品溶液,各取10μL按标准曲线项下方法显色以及测定吸光度，并利用标准曲线方程计算总皂苷含量。

2.2 提取方法的选择

两头尖总皂苷的提取采用回流、超声和微波3种方法，以总皂苷含量为指标，对3种提取方法进行比较，并采取正交实验法对提取工艺进行改进，结果见表2。

2.2.1 药材粗粉脱脂 精密称取两头尖粗粉100g，按5倍量，3倍量乙醚47.5℃水浴回流2次，每次2h，合并抽滤，药渣乙醚挥干后备用。

2.2.2 回流法 精密称取两头尖粗粉20.000 g，按6倍量70%乙醇85℃水浴回流，2次，每次1h，合并抽滤液，回收乙醇，继续水浴挥至稠膏，烘箱干燥至恒重。

2.2.3 超声法 精密称取两头尖药材粗粉20.010 g，按6倍量70%乙醇60℃超声提取，2次，每次30min，合并抽滤液，回收乙醇，继续水浴挥至稠膏，烘箱干燥至恒重。

2.2.4 微波法 精密称取两头尖药材粗粉20.024 g，用15倍量70%乙醇提取1次，5min，功率225W，每30s停1次（防止温度过高，温度控制在85℃以下）抽滤，回收乙醇，继续水浴挥至稠膏,烘箱干燥至恒重。

表1 两头尖总皂苷提取方法比较

用微波法,超声波法和回流法对两头尖总皂苷进行提取,比较3种提取方法的差异,结果如表1所示。由表1可以看出:微波法提取的两头尖总皂苷的提取率,远高于回流提取2h和超声法提取,且微波法可在低温操作，简单易行，从节能、省时等多方面角度来看,微波法优于回流提取和超声波提取法，应选用微波提取法作为正交设计实验的提取工艺。

2.3 正交设计优化微波提取工艺

2.3.1 设计因素水平 从表1结果中可以看出，以乙醇微波提取的效果最佳，故采用乙醇微波提取总皂苷.经过预实验确定3个因素，即乙醇浓度（A）、提取时间（B）及溶媒比（C），根据实验，每个因素设计3个水平，用L9（34）正交表进行实验（见表3），以提取液中两头尖总皂苷的提取率作为指标。

2.3.2 样品制备 精密称取两头尖粗粉10g，根据表3中实验设计进行实验，得提取液，回收乙醇，于蒸发皿中浓缩至干。按2.1.2项下进行含量测定。结果见表3，方差分析结果见表4。

表2 L9（34）实验因素水平表

表3 L9（34）实验及结果

表4 方差分析结果

2.3.3 方差分析 由表3的极差可知,影响两头尖皂苷得率的各因素中,其主次顺序依次为乙醇浓度>提取时间>溶媒比,即乙醇浓度对皂苷得率的影响最大,溶媒比对皂苷得率的影响最小。表4的方差分析表明,乙醇浓度对两头尖皂苷得率具有极显著影响,提取时间、溶媒比对皂苷得率影响不大。

本实验结果表明，60%乙醇微波提取的效果最佳，误差为空白，乙醇浓度变化对结果有显著性影响，故乙醇浓度作为主要因素.分析结果表明，A因素选1水平，B因素，C因素对结果变化无显著性影响，可任选一水平或者中间水平，如果从经济学角度考虑，C因素应选1水平，故该药材提取的最佳工艺为A1 B2 C1，即使用60%的乙醇，加入的溶剂为药材量的10倍，微波提取8min为好。

2.4 验证试验

为进一步验证优选方法的可靠性,取3 份药材,每份10 g,按优选得到的工艺条件进行验证试验,操作方法同前,结果总皂苷提取率分别为：3.44%,3.24%，3.19%，与正交试验结果吻合，表明工艺可行。

3 讨 论

国内关于两头尖提取工艺的文献较少，且制备供试液时多采用传统的乙醇回流法，本实验采用微波法对两头尖药材进行提取，结果表明本法操作较简便、省时，提取率较高。

目前微波技术在中药辅助提取方面的研究仍处于初期阶段，微波技术提取药物有效成分还应考虑溶剂浸泡时间、物料厚度、微波辐照剂量等因素对提取率的影响。微波辅助提取的机理似乎更依赖于被提取物的基体。在微波作用下，富含水的部分优先破壁，而含水少的细胞则比较滞后，甚至不被微波破壁，如果所提取的有效成分不在富含水的部位，微波提取则难以进行。在微波剂量、物料厚度、自由水和结合水的含量等对提取率的影响方面尚没有系统的研究，微波辅助提取设备也有待于进一步开发。

参考文献

［1］ 〖ZK（#〗刘大有.两头尖有效成分的研究［J］.吉林农业大学学报，1983，5（2）：75.

［2］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典・1部［S］.北京:化学工业出版社,2005:116.

［3］ 吴凤锷,朱子清.中药竹节香附化学成分的研究（Ⅲ）［J］.高等学校化学报,1985,6（1） :36-40.

［4］ 匡海学,田振坤,张宁.两头尖的化学成分研究［J］.中草药,1996,27 （6） :328-330.

［5］ 路金才,徐,张新艳,等.两头尖的化学成分研究［J］.药学学报,2002,37 （9） :709-712.

［6］ 黎海彬，李琳，郭祀远，等.药用植物有效成分提取技术［J］. 现代化工，2002，22（5）：59-62.

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［8］ Vior L，Yang R.Microwave―assisted extraction of organic compounds from standard reference soils and sediments［J］.Anal Chem，1994，66：1097-1106.