银屑病患者中CXC型趋化因子受体CXCR2 mRNA 的表达*

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杨桂兰，陈志强，郑家润，李新宇，陈 ?V，李遇梅，高建明

【摘要】 目的 测定CXC型趋化因子受体CXCR2 mRNA在银屑病患者中的表达情况，弄清该受体在银屑病患者中的病理生理状态，探讨其在银屑病发病机制中的作用。方法 应用逆转录—聚合酶链反应（RT-PCR）法检测33例进行期斑块型银屑病患者治疗前皮损部位、皮损周围外观正常皮肤和外周血中性粒细胞、单一核细胞及其中16例治疗至皮损消退70％以上的患者外周血中性粒细胞与单一核细胞中cxcR2 mRNA的表达水平，并设30例健康人为对照组。将检测结果与银屑病皮损面积及严重程度指数（PASI）及外周血中性粒细胞、单一核细胞中该受体的表达水平与皮损部位表达水平之间分别进行了相关性分析。结果 银屑病患者皮损部位表皮与真皮中CXCR2 mRNA表达水平分别为1.85±0.76和1.23±0.48，明显高于皮损周围外观正常皮肤表皮及真皮(分别为0.63±0.48和0.86±0.39；分别P＜0.001，P＜0.01)，及健康对照者皮肤表皮及真皮（分别为0.59±0.21和0.55±0.48，P均＜0.001)，且均与PASI呈显著正相关（表皮：r=0.86，P＜0.001; 真皮：r=0.38，P＜0.05）。银屑病患者外周血中性粒细胞中CXCR2 mRNA表达水平为1.45±0.87，明显高于健康对照及治疗后患者（分别为0.74±0.58，P＜0.001； 0.63±0.58，P＜0.01），并与PASI呈显著正相关（r=0.84，P＜0.001）。银屑病患者外周血单一核白细胞中CXCR2 mRNA的表达水平为1.38±0.87，明显高于健康对照组（0.73±0.58，P＜0.001)。银屑病患者皮损部位表皮中CXCR2 mRNA的表达水平与外周血中性粒细胞中该受体的表达水平呈正相关（r=0.61，P＜0.001）； 银屑病患者皮损部位真皮中CXCR2 mRNA的表达水平与外周血单一核白细胞中的该受体的表达水平呈正相关（r=0.64，P＜0.001）。结论 CXCR2在银屑病患者中的表达均异常增高，可能参与了银屑病的发病机制。

【关键词】 银屑病；受体；趋化因子

【Abstract】 Objective To investigate the expression levels of chemokine receptors CXCR2 in progressive plaque psoriasis and their clinical significance.Methods Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) technique was applied to semi-quantitatively analyze CXCR2 mRNA expression levels in epidermis and dermis from lesion and peri-lesion skin，Peripheral Blood polymorphonuclears(PMN)and peripheral blood mononuclear cells(PBMC) in each of 33 cases of psoriatic patients before treatment and PMN and PBMC in16 cases from the 33 patients treated until the skin lesions remission about 70% and 30 healthy controls.The correlations between CXCR2 mRNA values and psoriatic area and severity index (PASI)，and between the CXCR2 mRNA values in PBMC and PMN and in leision dermis and epidermis were evaluated，respectively.Results （1）The CXCR2 mRNA levels in lesion epidermis and dermis in psoriatic patients were 1.85±0.76 and 1.23±0.48，respectively，which were markedly higher than those in peri-lesion epidermis and dermis（0.63±0.48 and 0.86±0.39，respectively，P＜0.001，P＜0.01，respectively) and normal epidermis and dermis（0.59±0.21 and 0.55±0.48，respectively，both P＜0.001).Furthermore，positive correlation were noticed both between epidermis CXCR2 mRNA values and PASI (r=0.86，P＜0.001)，and dermis CXCR2 mRNA values and PASI(r=0.38，P＜0.05).（2）The CXCR2 mRNA levels in PMN from psoriatic patients were 1.45±0.87，which were markedly higher than those in normal controls and treated patients（0.74±0.58，P＜0.001 and 0.63±0.58，P＜0.01 respectively）. Positive correlation were noticed between CXCR2 mRNA values and PASI（r=0.84，P＜0.001）.（3） CXCR2 mRNA expression levels in PBMC from psoriatic patients were 1.38±0.87，which were markedly higher than those in normal controls（0.73±0.58，P＜0.001) but similar with treated patients(1.21±0.62)，furthermore，the later were also markedly higher than those in normal controls(P＜0.05).（4）Positive correlation were noticed between the CXCR2 mRNA values in lesion epidermis and inPMN，and in lesional dermis and in PBMC，respectively.Conclusion The increased expression of CXCR2 maybe involved in the pathogenesis of progressive plaque psoriasis.

【Key words】 psoriasis；receptor；Chemokine CXCR2

银屑病是一种慢性炎症性疾病，病因及发病机制至今仍尚未完全明确。现认为银屑病的发病主要涉及免疫、炎症、新血管生成及角质形成细胞过度增殖等四个方面。趋化因子及其受体系统具有广泛的生物学作用，在免疫及炎症过程中起着重要作用。趋化因子通过趋化因子受体发挥作用。cxcr2为CXC型趋化因子白介素8（IL-8）及生长相关癌基因α（GRO-α）的特异性受体，已有研究显示银屑病皮损部位 IL-8 及GRO-α增高，为了解趋化因子受体在银屑病患者中的病理生理状态，笔者用RT-PCR法检测了CXC型趋化因子受体CXCR2在银屑病患者中的表达情况。

1 资料与方法

1.1 病例选择 明确诊断的中重度进行期斑块状银屑病患者33例，均为2002年3～12月在我院就诊的门诊或住院患者，男19例，女14 例，年龄18～65岁，平均（34.71±10.26）岁，病程4个月～40年，平均（9.76±7.35）年。用PASI评分法来评估患者的疾病严重程度。入选标准：年龄在18周岁以上，诊断明确，PASI评分在8.4以上；近3个月内未用过维甲酸制剂、皮质类固醇激素及免疫抑制剂，1个月内未用过治疗银屑病的内服及外用药物，无其他系统性疾病或皮肤疾病。排除标准：近半年内服用过皮质类固醇、免疫抑制剂或维甲酸制剂；近1个月内服用过口服治疗银屑病或其他系统治疗药物，近1个月内外用过治疗银屑病的药物；伴有糖尿病、高血压等其他系统性疾病；患者就诊时怀孕、哺乳或处于月经期。

1.2 标本收集 对符合上述入选标准的患者详细记录病史资料，然后自肘静脉取血8ml加入肝素抗凝管备分离白细胞；接着用8mm角膜环钻分别自皮损部位及皮损周围外观正常皮肤各钻取一块皮肤组织，钻取深度以达到真皮全层为宜，用刀片沿皮面平行切下皮肤组织，迅速放入液氮中速冻或直接用0.25%分散酶消化。标本收集完毕后根据患者的病情给予相应的抗银屑病药物治疗，病情较轻者给予口服银屑冲剂或复方青黛丸，外用煤焦油凝胶、硫柳软膏及去炎松霜等，病情较重者给予口服雷公藤、红霉素及外用煤焦油凝胶、硫柳软膏及去炎松霜等。上述患者经有效治疗至皮损消退70%以上时取疗后血，取血前再次对患者进行PASI评分，共收集到16例治疗后患者。正常对照30例，均来自我院研究生、体检职工及皮肤外科整形美容的患者，年龄、性别与患者具有可比性。

1.3 主要仪器及试剂 XL-70超高速离心机（BECKMAN），Hema 480基因扩增仪（珠海黑马医学仪器有限公司），TFX-20M紫外检测仪（Vilber lourmat 法国），CS-9000双波长飞点薄层扫描仪（日本岛津）。Trizol （GIBICO/BRL），Super ScriptTM First-Strand Synthesis System for RT-PCR（Invitrogen），TaqDNA聚合酶（Promega），DN段长度标准（上海华美生物工程公司），琼脂糖（Promega）。

1.4 特异性引物 CXCR2 5?- CTTTTCTACTAGATGCCGC -3?，5?-AGATGCTGAGACATATGAATTT -3?，扩增片段为417bp；β-Actin 5?-CAACTCCATCA TGAAGTGGTAAC -3?，5?-CCACACGGAGTACTTGCGCGCCTC-3?扩增片段为180bp，所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.5 方法

1.5.1 表真皮分离 用0.25%分散酶消化分离真表皮，分离后的真表皮分别被置入2个加入Trizol的玻璃研磨器中匀浆备用。

1.5.2 中性粒细胞与单一核细胞的分离 将肝素抗凝静脉血8ml用无钙、镁Hank液对倍稀释，以4∶1的比例向稀释后的血中加入6%葡聚糖，混匀后37℃静置40min，静置后含上述液体的血液混合物分为两层，上层清亮液中含有白细胞。取上层清亮液以3∶2比例沿管壁缓慢加至另一试管中的分层液表面，2000r/min 离心20 min，离心后单一核白细胞位于上层血浆与下层分层液的交界处，中性粒细胞位于管底，分别将单一核白细胞及中性粒细胞移入干燥试管，各用5倍于细胞的Hank液洗2次，在显微镜下记数，取2×106个单一核白细胞及8×106个中性粒细胞加入Trizol备用。

1.5.3 提取RNA 采用Trizol试剂，按说明书操作提取RNA。

1.5.4 反转录合成cDNA 严格按照Invitrogen的试剂盒说明书进行操作。合成cDNA的总体积为20μl。具体如下：10mmol/L dNTP mix 1μl，Oligo（DT）12-181μl，RNA模板8μl，65℃孵育5min，置于冰上至少1min，加入由10×RT 缓冲液2μl，25mmol/L MgCl2 4μl，0.1mmol/L 二硫苏醇糖（DTT） 2μl，RNA酶抑制剂1μl组成的反应混合物9μl，42℃孵育2min，加入逆转录酶1μl，42℃孵育50 min，70℃孵育15min终止反应，置于冰上至少1min，加入RNA酶1μl，37℃孵育20min，去除残余的RNA，获得cDNA。

1.5.5 PCR扩增 反应总体积为25μl，包括10×PCR缓冲液2.5μl，25mmol/L MgCL2 1.5μl，10 mmol/L dNTP mix 0.5μl，等量上下游引物混合物1μl，相应cDNA 1μl。扩增条件为： 94℃预变性5min。94℃变性33s； 57℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸7min。以β-Actin作为内参照进行半定量。

1.5.6 电泳及照相 用2%琼脂糖凝胶，电泳缓冲液用0.5×Tris-硼酸，以每厘米胶长5V的电压进行电泳，1h后在紫外发射仪上观察结果并进行近距离摄影。

1.6 图像分析及统计学方法 胶片用薄层扫描仪扫描，所有扩增产物的扫描峰面积值均以相应β-Actin为基准校正后得到扩增产物的相对半定量值。统计学分析采用SPSS 10.0软件包进行处理，采用方差分析法对各组数据进行组间比较。相关性分析采用Pearson模型。

2 结果

治疗前患者的PASI评分为8.4～47.2，平均27.26±8.84；所收集到的治疗后患者的PASI评分治疗前为10.8～43.2，平均25.61±10.78，治疗后为1.2～15.3，平均5.02±3.90，治疗后比治疗前平均下降了80.75%。CXCR2 mrna的表达情况见表1及图1～4。

表1 银屑病患者中趋化因子受体CXCR 2mRNA表达水平 （x±s）

注：为银屑病患者皮损部位(治疗前白细胞)/皮损周围(治疗后白细胞)与健康人对照比较；为银屑病患者皮损部位(治疗前白细胞)与皮损周围(治疗后白细胞)比较

图1 表皮中CXCR2 mRNA电泳图 图2 真皮中CXCR2 mRNA电泳图

图3 中性粒细胞中CXCR2电泳图 图4 单一核细胞中CXCR2电泳

所测健康对照标本中均存在一定量的CXCR2 mRNA表达。在银屑病患者皮损部位表皮及真皮中，CXCR2 mRNA表达水平均明显高于健康人对照皮肤及同一组患者皮损边缘外观正常皮肤的表皮和真皮，差异均具有非常显著性（P均＜0.001），银屑病皮损周围外观正常皮肤真皮表达CXCR2 mRNA亦高于健康人对照组（P＜0.01）。以PASI-CXCR2进行直线回归分析，结果表皮及真皮中CXCR2 mRNA表达水平与PASI之间均存在明显正相关性，分别为：表皮 r=0.86，P＜0.001；真皮r=0.38，P＜0.05。

在中性粒细胞中，治疗前银屑病患者CXCR2 mRNA表达水平显著高于健康人对照组（P＜0.001），并与PASI评分之间均存在正相关（r=0.84，P＜0.001）；治疗前银屑病患者CXCR2 mRNA表达水平也明显高于治疗后患者（P＜0.01）；治疗后患者与健康人对照组相比较差异无显著性。

在单一核细胞中，治疗前银屑病患者CXCR2 mRNA表达水平明显高于健康人对照组(P＜0.001)，但与PASI之间无明显相关性（ r=－0.122，P＞0.05）。治疗后患者仍高于健康人对照组(P＜0.05)，但同一组患者治疗前后相比较差异无显著性 (P＞0.05)。

银屑病患者皮损部位表皮中CXCR2 mRNA的表达水平与外周血中性粒细胞中该受体的表达水平呈正相关（r=0.61，P＜0.001）； 银屑病患者皮损部位真皮中CXCR2 mRNA的表达水平与外周血单一核白细胞中的该受体的表达水平呈正相关（r=0.64，P＜0.001）。

3 讨论

趋化因子是主要使细胞发生趋化作用的细胞因子，它们均具有特征性的同源氨基酸序列，几乎所有的趋化因子均含有4个保守的半胱氨酸为其特征，从基因及蛋白质结构上可将趋化因子分成4型，即CXC型（氨基末端的两个半胱氨酸之间被另一氨基酸隔开）、CC型（氨基末端的两个半胱氨酸相毗邻）、C型（氨基末端仅有1个半胱氨酸）及 CX3C型（氨基末端两个半胱氨酸之间有3个氨基酸）。趋化因子通过与其特异性受体结合发挥作用，相应的趋化因子受体也分为CXC、CC、XC及CX3C等4型。在免疫及炎症反应中该系统不仅参与炎症细胞的活化、增殖及向炎症部位的移行，而且通过自分泌及旁分泌途径参与了免疫调节、新血管生成等病理过程，从而对免疫及炎症反应的调节起到重要作用。

表皮中角质形成细胞过度增殖及分化异常是银屑病的基本病理特征。体外研究显示IL-8具有刺激角质形成细胞增生的作用，IL-8需与其特异性受体结合才能活化角质形成细胞并使之发生增殖，CXCR2为IL-8的特异性受体。银屑病患者表皮中存在大量IL-8［1］，培养的银屑病皮损部位角质形成细胞分泌IL-8增加，其上清液对中性粒细胞的趋化作用较健康人的明显增强［2］。笔者用RT-PCR检测发现健康人表皮中存在少量CXCR2 mRNA的表达，提示CXCR2可能参与了正常表皮的增生与分化。Kulke 等［3］的研究结果表明银屑病皮损部位角质形成细胞表达CXCR2增高，作者认为CXCR2可能参与了银屑病表皮角质形成细胞的活化、增生及分化。

皮损部位中性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞浸润也是银屑病的基本病理特征。银屑病的主要病理特点之一为皮损部位角质层内白细胞浸润形成Munro微脓肿，这主要是由白细胞自真皮微上端毛细血管向表皮游走所致，这是个十分复杂的过程，涉及诸多细胞因子及免疫分子共同形成的网络，趋化因子及其受体在其中起到了至关重要的作用［4］。IL-8除作为角质形成细胞活化因子外，和GRO-α一道还是组织炎症的介导者，对中性粒细胞及单核细胞具有重要的生物学作用。现认为T细胞依赖性免疫机制在银屑病的发病机制中起着核心作用［5］，但对T细胞在皮损部位聚集的机制仍未完全阐明，多种细胞因子及黏附分子可能参与了T 细胞的调节。IL-8、GRO-α在体外均可趋化T细胞［6，7］，因此推测IL-8、GRO-α和CXCR2相互作用，可能也对T细胞向炎症部位的移行起作用。银屑病皮损部位真皮具有高表达的GRO-α［1］，皮损部位真皮浸润的中性粒细胞表达 CXCR2 mRNA 增高［3］。但Kulke 等［3］发现皮损部位角质层中聚集的中性粒细胞表面测不到CXCR2，提示当中性粒细胞已到达角质层后，CXCR2的表达明显减少，推测可能是因为中性粒细胞在向皮损部位表皮中移行的过程中发挥了功能后产生了某些变化，失去了其原有特征的结果。

本研究结果表明银屑病患者皮损部位表皮和真皮、外周血中性粒细胞及单一核细胞中表达CXCR2 mRNA均增高，提示CXCR2不但参与了银屑病皮损部位病理状态的形成，还参与了中性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞向银屑病皮损部位的移行，进而对皮损部位炎症反应的形成及维持起到重要作用。银屑病皮损部位表皮及真皮中趋化因子受体CXCR2 mRNA表达水平均增高并均与PASI之间呈正相关，提示银屑病皮损部位CXCR2 mRNA表达水平与皮损严重程度相一致；银屑病患者外周血中性粒细胞中CXCR2 mRNA表达增高并在抗银屑病有效治疗后随着病情的好转而下降，提示CXCR2的高表达与中性粒细胞的活化有关，高表达CXCR2的外周血中性粒细胞与皮损部位增高表达的IL-8及GRO-α发生特异性相互作用，使得中性粒细胞容易趋化至皮损炎症部位，银屑病皮损部位表皮中CXCR2 mRNA的表达水平与外周血中性粒细胞中该受体的表达水平呈正相关，提示皮损局部表皮中高表达的CXCR2 mRNA可能部分来自浸润的中性粒细胞；银屑病患者PBMC中CXCR2 mRNA表达水平增高，但与PASI之间无相关性，并且增高表达的CXCR2 mRNA不随治疗好转而降低，提示CXCR2可能对中性粒细胞的活化及趋化起到更为重要的作用，而在淋巴细胞的激活及向皮损部位移行过程中，除CXCR2外可能还存在其他趋化因子/受体的作用。银屑病患者皮损部位真皮中CXCR2 mRNA的表达水平与外周血单一核白细胞中的该受体的表达水平呈正相关，提示皮损局部真皮中高表达的CXCR2 mRNA可能部分来自浸润的单一核白细胞。

结合文献报道，笔者认为CXCR2通过与其相应配体结合，在银屑病的病理生理中起着重要角色。另外，本组检测的结果银屑病患者皮损周围外观正常皮肤真皮中CXCR2 mRNA表达水平也均高于健康人对照，这可能与银屑病的同形反应之间存在一定关系，说明银屑病患者皮损周围外观正常皮肤真皮也存在某些异常，具有转变成银屑病皮损的潜能，在一定因素的诱发下即可发展为银屑病皮损。

【参考文献】

1 Gillitzer R，Berger R，Mielke V，et al. Upper keratinocyte of psoriatic skin lesions express high levels of NAP1/IL-8 mRNA in situ. J Invest Dermatol，1991，97:73-79.

2 唐玲，于益之，顾军，等.白介素8及趋化因子受体CXCR2在银屑病角质形成细胞中的表达.中华皮肤科杂志，2002，35：105-107.

3 Kulke R，Bornscheuer E，Schluter C，et al. The CXC receptor2 is overexpressed in psoriatic epidermis. J Invest Dermatol，1998，110:90-94.

4 Springer TA. Traffic signals for lymphocyte recircuLation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell，1994，76(2):331-314.

5 Gillitzer R，Wolff K，Tong K，et al. MCP-1mRAN expression in basal keratinocyte of psoriatic lesions. J Invest Dermatol，1993，101:127-131.

6 Larson CG，Andersen AO，Appella E，et al. The neutrophil-activing protein (NAP-1) is also chemotactic for T lymphocyte. Science，1989，243:1464-1466.

7 Jinquan T，Frydenberg J，Mukaida N，et al. Recombinant human growth-regulated oncogen-αinduce T lymphocyte chemotaxis. J Immunol，1995，155:5359-5368.