氮磷对红球藻叶绿素含量的影响
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雨生红球藻( Haematococcus pluvialis) 是一种单细胞淡水绿藻，在胁迫条件下其红色不动孢子能快速合成虾青素，目前已经成为国际上研究的热点。N、P 是雨生红球藻培养中最基本的营养元素，其研究与应用是雨生红球藻研究和开发的基本技术条件。近年来，国内外学者对 N、P 等常量元素对雨生红球藻的生长及虾青素积累的影响等方面进行了相关研究［1 －3］。叶绿素荧光技术是以植物体内叶绿素作为天然探针，研究和探测植物光合生理状况及各种外界因子对其细微影响的新型植物活体测定和诊断技术［4］，包含丰富的光合作用信息，极易受到逆境的影响，是快速、灵敏和无损伤地研究和测定逆境对植物光合作用的理想方法。国内外不少学者研究了营养盐浓度对微藻生长及叶绿素荧光特性的影响［5 －8］。本实验利用叶绿素荧光技术检测雨生红球藻在不同 N、P 浓度下的叶绿素荧光参数，通过对数据的分析，得到雨生红球藻受营养盐胁迫的情况，并揭示雨生红球藻叶绿素荧光参数与细胞密度的相关性，以此来检验叶绿素荧光技术在雨生红球藻选育中应用的可行性。
1 实验材料与方法
1. 1 实验藻种
雨生红球藻( Haematococcus Pluvialis) 藻种由中国科学院海洋研究所提供。
1. 2 微藻培养及实验设计
对雨生红球藻进行 2 个单因子( N 浓度、P 浓度) 的培养实验。实验在 500 mL 三角瓶中进行，不 充 气，连 续 光 照，光 照 强 度 为 50 μmolE/( m2•s) ，温度为( 22 ±1) ℃。浓度梯度设置如下:N 浓度: 0、110、220、440、880、1 760、3520 μmol / L;P 浓 度: 0、 4. 54、 9. 08、 18. 16、 36. 32、72. 64 μmol / L。除各处理组中 N 浓度、P 浓度外，其他营养盐均采用 f/2 培养基配置方法( 表 1) ，每个处理设 3个平行组，每日随机调换三角瓶并摇动 3 ～ 5 次。每天定时测细胞密度及叶绿素荧光参数。
1. 3 参数测定
叶绿素含量的测定: 用德国 Walz 公司产 Water－ PAM 水样叶绿素荧光仪( Walz，Effectnich，Ger-many) 进行叶绿素含量的测定，由于瞬间荧光产量( F 值) 和叶绿素浓度在一定范围内成正比，通过校正可测出叶绿素含量。为避免校正过程中可能产生的误差，文中的叶绿素含量用相对含量( 每次测得的叶绿素含量与接种时叶绿素含量的比值) 表示。叶绿素荧光参数的测定: 用德国 Walz 公司产Water － PAM 水样叶绿素荧光仪 ( Walz，Effeltrich，Germany) 进行叶绿素荧光各个参数的测定。测量前将微藻样品暗适应 15 min。叶绿素荧光参数 Fv/Fm及 ETR 可在荧光仪上直接读出。
1. 4 数据处理
用 Sigmaplot10. 0 软件作图。用 SPSS11. 5 软件分别进行单因子方差分析和多重比较( P ＜0. 05 表示差异显著) 以及相关性分析。
2 结果
2. 1 氮浓度对雨生红球藻叶绿素荧光参数及生长的影响
氮浓度对雨生红球藻叶绿素荧光参数及生长的影响见图 1。单因子方差分析结果表明，整个培养周期中，氮浓度对荧光参数 Fv/ Fm、ETR、叶绿素相对含量及细胞密度均有显著影响( P ＜0. 05) 。由图中可以看出，在整个培养周期中，Fv/ Fm呈现为下降趋势，ETR 呈现为先上升后下降的趋势，无氮组 Fv/ Fm、ETR 下降幅度最大，与第 1 天相比，培 养 结 束 时 分 别 下 降 了 8. 28%、24. 24%、3. 75% 、3. 73% 。多重比较结果表明，从接种后第3 天开始，氮浓度为 1 760 μmol / L 的处理组叶绿素相对含量和细胞密度均显著高于其它处理组( P ＜0. 05) 。由表 2 可以看出，各荧光参数及叶绿素相对含量与细胞密度的相关性与培养时间有关，培养2 ～ 6 d 时，Fv/ Fm与细胞密度呈显著的正相关关系; 培养 9 ～ 10 d 时，Fv/ Fm、ETR 与细胞密度呈显著的负相关关系。在整个培养周期中，雨生红球藻的叶绿素相对含量均与细胞密度呈极显著的正相关关系。
2. 2 磷浓度对雨生红球藻叶绿素荧光参数的影响
磷浓度对雨生红球藻叶绿素荧光参数的影响见图 2。单因子方差分析结果表明，整个培养周期中，磷浓度对荧光参数 Fv/ Fm、ETR、叶绿素相对含量及细胞密度均有显著影响( P ＜0. 05) 。由图中可以看出，在整个培养周期中，Fv/ Fm呈现为下降趋势，ETR 呈现为先上升后下降的趋势。多重结果表明，从接种后第 5 天开始，无磷组的 Fv/ Fm、ETR 均显著高于其它处理组( P ＜ 0. 05) ，其他各组间的差异不显著。从接种后第 2 天开始，无磷组的叶绿素相对含量和细胞密度均显著低于其它处理组( P ＜0. 05) ，其他各组间的差异不显著。雨生红球藻的荧光参数及叶绿素相对含量与细胞密度之间的相关关系见表 3，各荧光参数与细胞密度的相关性与培养时间有关，培养 5 ～ 10 天时，Fv/ Fm、ETR与细胞密度呈显著的负相关关系。在整个培养周期中，雨生红球藻的叶绿素相对含量均与细胞密度呈显著的正相关关系。
3 讨论
叶绿素荧光是研究植物光合作用的良好探针，通过对各荧光参数的分析可得到有关光能利用途径的信息。Fv/ Fm是 PSII 的最大光化学量子产量，反映 PSII 的最大光能转换效率，非胁迫条件下该参数的变化极小，不受物种和生长条件的影响 ，胁迫条件下该参数明显下降。ETR 表示 PSII 的表观电子传递速率 。缺氮影响微藻的生长发育，尤其是对包括叶绿素分子在内的蛋白质的合成影响极大。因此，缺氮势必导致 PSI 以及 PSII 的功能降低，影响光化学能量的转换。本实验中，N 浓度为 0μmol /L 时( 无外源性 N 的天然海水中) ，雨生红球藻的 Fv/ Fm比值从接种时的0. 6 下降至培养结束时的 0. 2。该条件下，微藻处于饥饿状态，此时生长不平衡，生长速率下降，所以雨生红球藻的荧光值都有很大下降，这与之前许多研究结果相同［9 －11］。从接种后第 6 天开始，氮浓度为 440、880、1 760μmol /L 处理组的荧光参数Fv/ Fm、ETR 显著高于其它各组; 另外，从接种后第 3 天开始，氮浓度为1760 μmol / L 的处理组叶绿素相对含量和细胞密度均显 著 低 于 其 它 处 理 组 ( P ＜0. 05) 。 因 此，H. pluvialis 的最适氮浓度为 1 760 μmol / L。氮浓度较低的培养条件下，藻细胞生长缓慢，藻细胞在经过短暂的几天对数生长后，很快停滞生长，实际光能转化效率、光合电子转化效率等逐渐降低，这种消退主要与 N 的迅速耗尽有关。由于不同的实验者侧重点有所不同，有的关注绿色游动细胞的生物量，而有的则侧重于最终虾青素的含量，因此得出不同的最适氮浓度。本实验结果与 Fabregas 等［9］、Borowitzka 等［12］的结论接近。而 Orosa 等［10］得出雨生红球藻生长的最适氮浓度为 0. 15 g/L 的硝酸钠，翟兴文等［11］得出雨生红球藻生长的最适氮浓度为硝酸钾 0. 1 mg/L，本实验结果与其相差甚远。磷对微藻的生长是必不可少的，梁英等［7］的研究表明，在磷限制的情况下，绿色巴夫藻的 Fv/Fm、ETR 均显著低于正常磷浓度条件下的对照组，其机理可能是低磷处理使光合磷酸化水平下降，Calvin 循环效率下降，光合速率降低所致。磷浓度过高也会起副作用，高磷组的 Fv/ Fm、ETR 均显著低于正常磷浓度条件下的对照组。本实验显示，当藻液中 P 的浓度为 0 μmol/L 时，培养结束时雨生红球藻的叶绿素含量明显低于其他各组 ( P ＜0. 05) 。这与以前学者的研究结果相同， Geider等［13］研究表明，三角褐指藻( Phaeodactylum tricorn-utum) 在 N、P 和铁限制时，Chla 浓度下降。本实验显示，当 P 的浓度为 0 μmol/L 时，与接种时相比，培养结束时雨生红球藻细胞密度增长明显减慢，说明在 P 浓度 0 μmol/L 时雨生红球藻细胞的生理受到 P 的严重限制，从最终细胞密度、叶绿素荧光参数看，各组磷浓度之间没有显著差异。传统的确定微藻最适的氮磷浓度的方法是测定不同培养条件下的细胞密度，但这种方法比较繁杂，耗时也较多。本实验相关性分析结果表明，雨生红球藻的叶绿素相对含量在整个实验周期内均与细胞密度呈显著正相关关系。因此，可以利用叶绿素相对含量的变化来反映雨生红球藻的生长情况。