大补阴汤含药血清对H460细胞的生长抑制作用

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李海波　李建春

摘　要：目的：探讨中药复方大补阴汤含药血清对人非小细胞性肺癌h460细胞的生长抑制作用。方法：将小鼠随机分为正常组、生理盐水组和大补阴汤组，连续灌胃给药7天后，眼眶取血，分离血清；生物倒置显微镜观察细胞形态变化，MTT法检测大补阴汤含药血清对人非小细胞性肺癌H460细胞的生长抑制作用。结果：大补阴汤作用H460细胞48h和72h以后，可见部分细胞变圆，体积变小，有凋亡小体产生。大补阴汤可时间依赖性抑制H460细胞的生长。结论：中药复方大补阴汤含药血清可以抑制H460细胞的增殖，为进一步探讨其抗肿瘤作用机制提供实验依据。

关键词：大补阴汤；血清药理；H460细胞

大补阴汤为补益类中药复方，该方出自《丹溪心法》，是滋阴降火的代表方剂。全方由熟地黄、龟板、知母、黄柏和猪脊髓组成。临床常用于相应的气虚阴虚病证，体内用药多起到满意的疗效。近年来的临床实验研究发现。其对慢性再生障碍性贫血、顽固性失眠、出血性疾病及恶性肿瘤等疾病具有较好的治疗作用。本实验引入血清药理学方法(即体内实验和体外实验结合的一种方法)，用服药后的小鼠血清(含药血清)代替中药煎剂作用于体外细胞，研究中药复方大补阴汤含药血清对人非小细胞性肺癌H460细胞的生长抑制作用。

1 实验材料

1．1 药品与仅器二氧化碳培养箱(HH・CP－1，上海)，生物倒置显微镜(AE20，Mode)，96孔培养板(Nune，Roskil-如，Denmark)，胎牛血清(天津灏阳生物试剂公司)，RPMI一1640培养基(GIBCO)，甲基噻唑蓝(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)。熟地黄、龟板、知母、黄柏(购自辽宁中医药大学附属医院药局)，猪脊髓(购自家乐福超市)。

1．2 实验动物昆明种小鼠30只(辽宁中医药大学实验动物中心提供)，雌雄各半，体重18-22g。

2　方法

2．1 细胞培养人非小细胞性肺癌H460细胞株(Ameri-can Type Culture Collection)，细胞单层接种在含5％胎牛血清，2％谷氨酰胺，RPMI-1640培养液中，在温度为37℃，C02浓度为5％的培养箱中培养。

2．2 中药复方液的制备大补阴汤(熟地黄15g，龟板15g，黄柏9g，知母各9g，猪脊髓)，上述中药复方药物成分，加水煎煮两遍，合并两次滤液，浓缩至每毫升含原中药复方成分生药1g。置4℃冰箱保存储备。

2．3含药血清的制备昆明种小鼠30只，雌雄各半，体重18～22g。共分为3组，每组10只，雌雄各半，即空白组、盐水组和大补阴汤组。连续7天灌胃给药，每日1次，每次每只0.4mL/10g。上述连续灌胃7天的小鼠，于眼眶取血，静置后离心分离血清10min(2000r/min)，56℃水浴灭活30min，经0.221xm微孔滤器过滤除菌(按1：9的比例将培养液加入原血清中)后，冻存备用。

2．4 细胞生长抑制实验取处于对数生长期的H460细胞，调整细胞密度为5×104/mL，以每孔100μL接种于96孔板。置于5％CO2、37℃的培养箱中培养24h后，吸出培养液，分别加入培养液、盐水、大补阴汤的含药血清液，每组重复3个孔。之后继续置于5％C02、37℃的培养箱中培养，加药作用12、24、36和48h后，每孔加入10μL MTT(5g/L)，继续培养4h后，弃上清，每孔加入100μL DMSO溶解，酶标仪492nm检测，绘制时效曲线。

抑制率(％)=[A492(阴性对照)-A492(大补阴汤)]/A492(阴性对照)×100％

2．5 细胞形态学变化每瓶1×106个细胞的密度接种于50mL细胞培养瓶中，培养24h后加入大补阴汤含药血清，分别于作用0、12、24、36和48h后用生物倒置显微镜观察。

3 结果

3．1 大补阴汤对H460细胞的生长抑制作用 大补阴汤于不同时间作用于H460细胞后，盐水组细胞的存活率随时间的增加而增加，而大补阴汤组细胞的存活率随时间的增加而减少。可见大补阴汤含药血清对H460细胞具有细胞毒作用并呈明显的时间依赖性。

3．2 细胞凋亡形态学观察光学显微镜观察，与正常对照组细胞相比，大补阴汤作用于H460细胞48h后，部分细胞变圆，体积变小，少量细胞表面发芽，细胞变成不规则状，芽脱落后形成凋亡小体，凋亡小体呈圆形或椭圆形，在凋亡小体内可见高度浓缩的染色质轮廓，作用72h后，可观察到凋亡的H460细胞数量增多，少部分细胞脱落，漂浮于培养液中，亦有少数细胞体积增大，细胞肿胀、破裂，呈坏死状。

4　讨论

血清药理学是近10多年来才逐渐兴起的一门实验方法学，是一种研究中药药效较为科学的方法。它是指将中药或中药复方经口给动物灌服一定时间后采集动物血液，分离血清，用此含有药物成分的血清进行体外实验的一种实验方法。血清药理学方法于1984年由日本学者首次提出，之后不断被运用于中西药的药理及药效学研究，对于中药复方的体外研究尤具优点。如将中药粗制直接加入体外培养细胞系，往往由于中药复方中较多的复杂成分、酸碱度、渗透压等影响实验结果，而且中药复方多数通过口服经体内代谢发挥直接或间接的治疗效果，体内外实验结果常不一致。而以中药复方饲服动物，定时采集血清，血清中含有中药的体内代谢产物及中药诱生的细胞因子等产物用于体外细胞实验更能反映中药的体内效应，提高实验结果的可信度。

大补阴汤出自朱震亨的《丹溪心法・补损五十一》，系朱氏滋阴降火学说的代表方。药由黄柏、知母、熟地、猪脊髓和龟板组成，猪脊髓为丸，功能滋阴降火，用治劳、潮热盗汗、骨蒸、咳嗽咯血、吐血以及消渴等症。近年来，临床应用报道大补阴汤对恶性肿瘤具有较好的治疗作用。为了使反应系统相对接近药物在体内转化的真实过程，增强中药方剂实验研究的科学性，本文采用血清药理学方法对大补阴汤的抗肿瘤作用进行了实验研究，结果表明大补阴汤含药血清对人非小细胞性肺癌H460细胞具有显著的抑制作用，为指导临床用药及进一步探讨补益类中药复方抗肿瘤作用机制提供了实验依据。