绵羊肺炎支原体固相竞争ELISA抗体检测方法的建立
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[摘 要] 本文依据固相竞争原理建立绵羊支原体固相竞争快速检测方法，通过方阵法确定包被抗原、竞争抗体和酶标二抗的使用浓度，单因素实验考察了反应时间和封闭剂对固相竞争反应体系的影响，确立了最优反应条件。
[中图分类号] S858 [文献标识码] A [文章编号] 1003-1650 （2015）10-0279-01
绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae，MO）是引起绵羊和山羊呼吸道疾病的最常见的病原之一。近年来，该病在世界上多个国家和地区普遍流行，对养羊业造成了巨大经济损失，严重威胁养羊业的健康发展。基于此，本研究在血清纯化的基础上建立了绵羊肺炎支原体固相竞争ELISA抗体检测方法，为相关疾病的有效的防控提供了保障。
1 材料
1.1 实验菌株 MOGH3-3绵羊肺炎支原体菌株由兰州兽医研究所提供
1.2 TSB-1培养基： 大豆胰蛋白肉汤（30g/L），乳糖（10g/L），酵母浸出液（100ml/L），10%马血清及青霉素（200U/ml）。
1.3 阴阳性血清样本 绵羊源支原体阳性样本63个，山羊源支原体阳性样本20个和46个支原体阴性血清样由兰州兽医研究所提供
1.4 试剂 新生牛、马、兔的血清购自兰州某生物公司； 辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG购自sigma公司； TMB购自sigma公司； 吐温-20 购自Solarbio 公司； 碳酸钠、碳酸氢钠、柠檬酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾等均为分析纯试剂。
1.5 仪器设备 iMARK 酶标仪、微量移液器、costar 96孔酶标板、落地式高速冷冻离心机、紫外可见分光光度计，恒温培养箱，电热恒温水槽。
2 方法
2.1 高免血清的制备
取冷冻保存MoGH3-3菌株连续传代培养复苏菌株，F6菌株接种TSB-1培养基，置37℃培养3d收获菌体。根据琼等建立的支原体膜蛋白提取方法制备免疫用膜蛋白抗原，将纯化的膜蛋白抗原加等量弗氏完全佐剂（Sigma公司产品）并完全乳化后，皮下多点注射免疫1.5千克～2.0千克健康公兔。首免后28天，用弗氏不完全佐剂（Sigma公司产品）等量乳化抗原，皮下多点注射兔子，加强免疫后7日耳静脉采少量血，1.0%琼脂扩散试验检测，效价达1：16以上时即可采血，分离血清，分装并于-20℃保存。
2.2 兔抗血清纯化
采集的高免兔抗血清使用HiTrap Protein A HP纯化柱纯化兔抗血清。上样前用10mL 0.1M的Tris-HCl 平衡纯化柱，兔抗血清和Tris-HCl缓冲液1：1混匀后上样，上样速度保持在0.5mL/min。上样结束后用10mL 0.1M的Tris-HCl洗涤纯化柱，洗去杂质蛋白。最后用5mL左右50mM甘氨酸溶液洗脱纯化柱，收集纯化蛋白，收集瓶预先加入0.1mL 的1.0M的Tris-HCl溶液，收集洗脱液缓慢摇匀，使其pH值恢复至中性。洗脱后用10mL 0.1M的Tris-HCl 平衡纯化柱，用5ml左右的20%乙醇充满纯化柱，以保存纯化柱。
2.3 竞争ELISA方法的建立
2.3.1 确定抗原、抗体和酶标二抗的使用浓度
2.3.1.1 抗原浓度确定
试验用方阵滴定法：用0.05mol/L 碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液（pH值为9.6）2倍系列稀释纯化后抗原（1：200～1：12800）横向包被酶标板，每孔100μl包被液， 4℃孵育过夜。PBST洗涤5次后，每孔加入兔抗血清100μl，37℃温育60min。竞争反应结束后每孔加入250μl PBST，洗涤5次，每孔加入50μl辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，37℃温育60min，PBST洗涤5次后每孔加入TMB底物溶液50μl 37℃反应15min后，加入50μl 1.25M H2SO4终止反应，读取OD450nm的光吸收值，通过吸光值的反应曲线确定包被抗原饱和浓度。
2.3.1.2 竞争抗体浓度确定
通过确定的抗原使用浓度包被酶标板，倍比稀释纯化后竞争抗体（1：400～1：25600）加入酶标板，每孔加入兔抗血清100μl，37℃温育60min。竞争反应结束后每孔加入250μl PBST，洗涤5次，每孔加入50μl辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，37℃温育60min，PBST洗涤5次后每孔加入TMB底物溶液50μl 37℃反应15min后，加入50μl 1.25M H2SO4终止反应，读取OD450nm的光吸收值，通过吸光值的反应曲线确定兔抗使用浓度。
2.3.1.3 酶标二抗浓度确定
参照2.3.1.2实验方法确定酶标二抗使用浓度。
2.3.2 二抗温育时间
抗原和竞争抗体按最适浓度稀释，二抗孵育时间选择37℃反应30min、45min、60min。测定阴阳性血清OD450nm值，比较各温育时间的P/N值，最后确定最佳的反应时间。
2.4 封闭条件
抗原包被过夜后，选择10%兔血清，10%牛血清和10%马血清封闭酶标板，37℃温育60min。按照2.3建立的方法检测阴阳性对照血清，最后读取OD450值，比较3种封闭剂的P/N值，确定最佳封闭条件。
3 结果
3.1 检测46份支原体阴性血清，83份阳性。检测阴性血清46份，其中2份可疑样本，特异性95.6%。阳性血清83份，敏感性100%。
表1 敏感性与特异性实验结果
3.2 检测方法测定24份支原体阴性血清，计算抑制率。平均抑制率为：X=0.127，标准差为S=0.042，临界值为PI=X+3S=0.25，则设定PI>0.25为阳性，PI
参考文献
[1]姚燕，马金萍，宋德荣. 贵州省绵羊支原体肺炎研究进展[J]. 现代农业科技，2015，05：294+296.
[2]张轩. 绵羊肺炎支原体多表位疫苗的研究及免疫试验[D].中国农业科学院，2013.