人工栽培蛹虫草菌种培养液发酵生产工艺流程

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摘要 蛹虫草是一种珍贵的药（食）用真菌，其功效与野生的冬虫夏草相似。目前已对蛹虫草子实体进行了人工栽培研究与示范。为了大规模化对蛹虫草子实体进行人工栽培，需要进行大量优质蛹虫草菌种培养液配备。因此，在已有研究的基础上，从优化发酵工艺方面入手，筛选出了最佳的发酵优化条件，提出了蛹虫草菌种培养液发酵生产工艺的关键控制要点，并对蛹虫草菌株种子液发酵生产中菌株活化、接种、液体摇培、发酵罐调试、发酵罐封装灭菌、发酵培养、保存等方面提出了具体的、明确的技术要求，为批量制备蛹虫草菌种培养液提供技术依据。

关键词 蛹虫草；人工栽培；种子液；扩大生产；工艺流程

中图分类号 S567.35 文献标识码 B 文章编号 1007-5739（2016）21-0075-01

蛹虫草（Cordyceps militaris）是一种珍贵的药（食）用真菌，寄生于鳞翅目昆虫蛹体后能形成真菌与昆虫复合体，属子囊菌纲，肉座菌目，麦角菌科，虫草属，与冬虫夏草（C.sinensis）同属异种，故又名北冬虫夏草、北虫草、蛹草、蛹草菌等[1-4]。已有研究表明，蛹虫草子实体中具有多种药用成分如虫草素、多糖和虫草酸，具有滋肺益气、增精益肾、止血化痰、抑制肿瘤、延缓衰老、增强免疫力等作用，并在市场上得到广泛应用[5-6]。由于野生蛹虫草大面积采挖已面临枯竭，目前人工蛹虫草已广泛栽培，在蛹虫草的人工栽培条件、化学成分组成、药理作用、临床医疗保健功效等方面取得了较大进展[6-7]。笔者也从新疆地区采集野生蛹虫草子实体进行了分离得到优良菌株，进行了人工栽培研究与示范，也取得了较好的效果[8]。为了大规模化对蛹虫草人工栽培，需要对批量优质蛹虫草菌悬液进行制备，才能满足扩大再生产需要。为此，笔者在已有实验室装备和研究的基础上，从优化发酵工艺方面入手，对发酵罐中培养调节温度、pH值、通气量等因素进行了控制，筛选出了最佳的发酵优化条件，制备的种子液满足扩大再生产的需要。现对蛹虫草菌种培养液发酵生产工艺流程进行了总结，以期为批量制备蛹虫草种子培养液提供技术依据。

1 供试菌株

供试菌株已经本实验室经单子囊孢子分离，进行分子生物学鉴定与人工筛选，获得了不同型MAT1-1和MAT1-2代表菌株[8-9]。

2 培养基制备

改良马铃薯（PDA）固体培养基[10]：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，琼脂16 g，磷酸二氢钾（KH2PO4）2 g，七水硫酸镁（MgSO4・7H2O）1 g，复合VB 25 mg，用水补至1 000 mL，pH值 6.5～7.0。改良PD培养基（g/L）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，磷酸二氢钾2 g，硫酸镁1 g，复合VB 25 mg，pH值6.5～7.0。种子发酵培养基采用改良PD培养基。

3 工艺流程

3.1 倒平板

将改良型PDA固体培养基加热熔化，待温度冷却至55～60 ℃时在无菌操作下倒入已灭菌的培养皿中，培养基冷却凝固后倒放备用。

3.2 活化

从冰箱中取出不同型MAT1-1和MAT1-2的蛹虫草优良菌种，在无菌操作下分别接种于改良型PDA培养基上，恒温培养箱21 ℃±1 ℃光照培养15～20 d，待菌株长至近培养皿边缘时放置4 ℃冰箱备用。

3.3 接种

将长满菌株的培养基从冰箱中取出，无菌条件下用灭菌牙签挑取少量粉色的分生孢子，接种至装有灭好菌的改良PD液体培养基的锥形瓶中。

3.4 液体摇培

将含有不同型的接N好的锥形瓶放在摇柜中进行摇培，170 r/min，（21±1） ℃下恒温震荡培养3～4 d，获得许多含有小米粒的菌丝球的少量种子菌悬液。

3.5 种子液扩大生产

以LiFlus GX发酵罐为例，进行了蛹虫草菌株种子液扩大生产，具体如下。

3.5.1 发酵罐调试。

（1）pH电极405-BPAS pH值校准。配制校准液（pH值分别为4.01和6.86），开机点主页面的calibration.继续pH calibration，先用蒸馏水润洗点击，再用餐巾纸擦拭，将配制好的标准液分别放入50 mL试管中，倒入15～20 mL即可。并将电极先后插入pH值6.86、pH值4.01的校准液中，静置与校准。

（2）溶氧电极INPRO 6800溶氧电极准备。将溶氧电极的下端5 cm处电极头旋开，用拇指盖抵住电极头下端金属圈将其内部结构取出来。在取出来的内部结构中倒满极化液，注意不能有气泡，否则底部的膜会破。

3.5.2 发酵罐封装灭菌。清洗发酵罐LiFlus GX各个部位，然后将各个电极安装到发酵罐上，将适量酸、碱倒入瓶中，并注意用皮筋底部扎口，目的是防止腐蚀皮管和发酵罐。并将各个出口用封口膜紧紧封住，用报纸包住冷凝管灭菌，一般121 ℃灭菌15～20 min，完成后快速移到无菌操作台下紫外灭菌30 min。

3.5.3 发酵培养。在无菌条件下按灭菌好的发酵培养基：种子菌悬液为10～15∶1（体积比）的比例倒入发酵罐，封好后移出。连接各个电极，开通各个电源，通过蠕动泵调节酸、碱通过皮管到达发酵罐并调成自动模式。设置发酵条件（温度20～25 ℃，pH值6.0～6.5，通气量1 mL/min），培养2～3 d，菌丝球布满培养液，发酵完成。

3.5.4 种子液保存。对超净工作台灭菌30 min，将发酵完成的发酵罐移到超净工作台中，用酒精棉球擦拭整个发酵罐体，将菌种培养液倒入已预先灭菌好的玻璃容器内，并用标鉴标注时间、条件、工作人员等信息，放入4 ℃冰箱保存备用。

4 参考文献

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