脂肪酶的固定化及固定化酶的应用

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摘要：脂肪酶是一种专一、高效的生物催化剂。文章简述了脂肪酶及其固定化方法，并对固定化脂肪酶的应用，特别是固定化脂肪酶催化剂在生物柴油上的应用进行了研究。

关键词：脂肪酶；固定化方法；生物柴油；吸附法；共价结合法；交联法

中图分类号：Q814 文献标识码：A 文章编号：1009-2374（2011）36-0078-02

一、脂肪酶及固定化脂肪酶研究现状

（一）脂肪酶简介

脂肪酶又称三酰基甘油酰基水解酶，是一类可以催化甘油三酯合成和分解的酶的总称，普遍存在于动、植物和微生物中，是一种专一、高效的生物催化剂。工业化的脂肪酶主要有动物脂肪酶（主要来动物的胰脏）和微生物脂肪酶。

（二）固定化脂肪酶研究现状

固定化酶是在1971年美国Henniker New Hampshire举行的酶工程会议上首次提出的，定义为酶用物理或化学方法固定在空间的一个特定区域保存酶的催化活性并且可以重复和连续使用。

早在20世纪90年代末，日本大坂政科技研究所对固定化脂肪酶催化转酯化植物油脂做了大量研究，并进行了初步工业化设计。利用丹麦诺维信（Novozymes）公司生产的固定化假丝酵母脂肪酶Novozym435，Y. Shimada等成功利用三步法（即每次分别加入1/3计量的甲醇）在30℃下反应48h，转化率达97.3%。

近几年，将酶固定化，使反应后酶可回收和多次重复利用，则有可能降低酶的使用成本，促进酶法合成工艺在酯交换反应制备生物柴油生产中的推广应用，然而在这方面国内仅有少数成功报道。

二、酶的固定化方法

酶的催化作用主要由其活性中心完成，酶蛋白的构象也与酶活性密切相关。因此酶的固定化应尽量在温和条件下进行，以避免酶蛋白的高级结构遭到破坏。

（一）吸附法

利用酶与载体吸附剂之间的非特异性吸附作用，将酶固定在吸附剂上。它分为物理吸附法和离子吸附法。物理吸附作用的因素有：范德华力、氢键、疏水作用和静电作用等。此法的优点是操作简单，处理条件温和，对酶的损害作用小。但同时也存在酶与载体相互作用力弱，酶易脱落等缺点。离子吸附法是酶通过离子键吸附于具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法。

（二）共价结合法

酶以共价键结合于载体的固定化方法。此法或是先将载体有关基团活化，然后与酶的有关基团发生偶联反应；或是在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。活化与偶联的方法多种多样，主要有重氮化法、溴化氰亚胺碳酸基法、芳香烃基化法等。与载体共价结合的酶的功能基团包括氨基、羧基、羟基、酚基等。由于酶与载体结合较牢固，酶不易脱落，稳定性好，在固定化酶的制备方法中此法研究最为活跃和深入。

（三）交联法

利用双功能或多功能试剂，使酶分子之间发生交联，凝集呈网状，而成固定化酶，戊二醛是应用最广的双功能试剂。此外，可用作交联剂的还有双重氨联苯4，4-异硫氰二苯基-2，2-二磺酸、甲苯-2-异氰酸-4-异硫氰酸等。此法与共价结合法一样，也是利用共价键固定酶，不同的是它不使用载体，交联法广泛应用于酶膜和免疫分子膜的制备，操作简单，结合牢固。

（四）包埋法

将酶分子包埋于凝胶的网眼中或半渗透的聚合物膜腔中，以达到固定化酶的方法。包括网格型和微囊型两种，网格和微囊的结构可以防止酶渗出到周围介质中，但底物仍能渗入到网格或微囊内与酶接触。包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率较高，因此可应用于许多酶、微生物和细胞器的固定化。

三、固定化脂肪酶的应用

（一）催化水解反应

油脂水解是将作为基质的油脂制成不均匀状，使之与水良好的接触，并采用催化剂来得到在两相间具有亲合性的化合物。一般认为，脂肪酶能够吸附在水-油两相的界面上，并在此相互作用。

（二）催化醇解反应

油脂的醇解反应，亦即油脂的甘油解反应。脂肪酶催化甘油解反应主要是利用三甘酯来制备单甘酯和双甘酯，通过加入特定的脂肪酶和控制反应条件可以获得不同量的单甘酯和双甘酯。

（三）催化酯化反应

脂肪酶可在水溶液中催化油脂的水解反应，也可在有机介质中催化酯化反应。张军等研究比较了14种不同来源的脂肪酶催化油酸油醇酯的合成，其中假丝酵母1619脂肪酶酯化能力最强，探讨了以硅藻土为载体固定化假丝酵母1619脂肪酶催化油酸油醇酯合成的最适条件，反应中去水，可使终酯化率提高到99%。

（四）催化转酯反应

天然脂肪酶的功能是使三甘油酯进行催化水解反应，但与许多其他的生物过程一样是可以转换的，脂肪酶在非水介质或无溶剂体系中也能催化酯的转酯化反应。

四、固定化脂肪酶催化剂在生物柴油上的应用

（一）生物柴油的制备方法

生物柴油是长碳链脂肪酸单酰酯类物质，主要是甲醇或乙醇等短碳链醇和脂肪酸或者甘油三酯经过酯化或者酯交换来生产。目前，合成生物柴油的主要方法是转酯化法，即动、植物油脂与短链脂肪醇在酸、碱或酶催化剂、或超临界条件下发生转酯化反应，生成相应的脂肪酸单酯和甘油，再经洗涤干燥处理即得相应产品生物柴油。

（二）固定化脂肪酶在制备生物柴油上的应用

酶法催化合成生物柴油，对原料品质没有特别要求。酶法不仅可以催化精炼的动植物油，同时也可以催化酸值较高且有一定水分含量的餐饮废油转化成生物柴油。酶法反应具有条件温和，副产品分离工艺较为简单，废水少，设备要求低等优点，日益受到人们的重视。刘志强等采用分步加醇脂肪酶催化菜籽油制备乙酯生物柴油，在醇油摩尔比5∶1，催化剂加入量10wt.%（油重），正己烷加入量15wt.%（油重）反应温度40℃，反应时间30h，甲醇分三次加入的条件下，最终测得酯交换转化率达93%。

近几年，随着石油资源的逐渐枯竭和公众环保意识的增强，可再生的绿色环保型燃料――生物柴油，受到许多国家的重视。化学法合成生物柴油的技术已经比较成熟，并且已经有了广泛的应用，但化学法合成生物柴油存在工艺复杂、醇消耗量过大，产物不易回收，环境污染大等缺点。而酶法制备生物柴油具有反应条件温和、醇用量小、产物易收集、对环境污染小等优点，固定化技术的运用为实现生物柴油工业化生产迈出了坚实的一步，其许多方面的优点都优于游离酶技术，但时至今日工业化实例仍然很少，最主要的原因是廉价、制备方法简单、活化效果好的固定化载体尚未找到。目前还只处在工艺探索阶段，但酶法合成生物柴油由于其特有的优点，一定有良好的工业化应用前景。

参考文献

[1] Watanabe Y， Shimada Y， Sugihara A， etal. Continuous Production of Biodiesel Fuel from Vegetable Oil Using Immobilized Candida antarctica Lipase. J Am Oil Chem Soc，2000，77（4）．

[2] 张军，徐家立．固定化假丝酵母1619脂肪酶催化油酸油醇酯的合成[J]．生物工程学报，1995，11（4）．

[3] 刘志强，李堂，周建江，等．分步加醇脂肪酶催化菜籽油制备乙酯生物柴油[J]．中国粮油学报，2008，3（23）．

作者简介：何慧艳（1986-），女，河南平顶山人，平煤神马股份帘子布公司浸胶二厂工艺技术员。