湖北野生桑黄分离鉴定及培养研究

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摘要：采用子实体组织分离法对桑黄（Inonotus sanghuang）进行分离，采用内转录间隔区序列分析对样品进行分子鉴定。用桑叶提取物对桑黄进行培养。结果表明，不同浓度桑叶提取物对桑黄生长存在不同程度的影响，最佳添加浓度为0.5%。在基础PDA培养基中添加0.5%桑叶提取物，桑黄生长速度为3.5 mm/d，与基础PDA培养基存在极显著差异。液体培养，菌丝体生物量达到11.7 g/L。桑叶提取物对桑黄菌丝体生长具有一定的促进作用。

关键词：桑黄（Inonotus sanghuang）；桑叶提取物；生长速度；液体培养

中图分类号：S567.3+9；S646.1+9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）12-3154-03

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.12.037

Abstract： Inonotus sanghuang was isolated by sub entity organization isolation method. It was identified by sequence analysis method of internal transcribed sequence and cultured with mulberry leaf extract. The results showed its growth was affected by different concentrations of mulberry leaves extract， and the best adding concentration was 0.5%. Based on conventional solid medium， which was added 0.5% mulberry leaf extract， its growth rate was 3.5 mm/d. There was a very significant difference between the control group and the control group. The biomass of mycelium was 11.7 g/L， and the liquid medium was used. Mulberry leaf extract has a certain role in promoting the growth of Inonotus sanghuang.

Key words： Inonotus sanghuang； mulberry leaf extract； growth rate； liquid culture

桑黄（Inonotus sanghuang）俗称桑臣、桑耳或胡孙眼等，是寄生于桑树等阔叶树上的一种多年生珍贵药用真菌，《神农本草经》、《本草纲目》等均有记载，有“森林黄金”的美称。桑黄含有多种活性物质，如多糖、黄酮和三萜类物质。研究显示，桑黄多糖能促使肿瘤细胞自我毁灭，防止肿瘤细胞附着于体内并抑制转移，抑制率达96.78%，是国际公认的最有效的抗癌真菌，其突出的抗肿瘤功效在日韩等国备受关注，具有极大的药用价值和开发潜力[1]。不同树种桑黄活性物质含量差异较大，以桑树桑黄含量最高[2-4]。

中国野生桑黄主要分布在东北、华北、西北及四川、云南等地。本课题组首次在湖北省内采集到野生桑树桑黄，对其进行分离鉴定，研究桑叶提取物对桑黄生长的影响，为下一步人工栽培研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

野生桑树桑黄由本课题组于2015年4月从湖北西部山区桑树上采集得到，系湖北省内首次发现。桑叶提取物（MLE）：取鲜桑叶，60 ℃烘干，取烘干桑叶500 g，加1 500 mL沸水浸提30 min，过滤，浓缩烘干提取液，得MLE。马铃薯葡萄糖（PDA）培养基：马铃薯200 g，去皮切丁，沸水煮20 min，取滤液，加葡萄糖20 g，加热溶解，补足水1 000 mL，pH自然。葡萄糖蛋白胨培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，水 1 000 mL，pH自然。MLE培养基：取一定量MLE，加水加热溶解，pH自然。PDA-MLE培养基：取PDA培养基，加入一定量MLE，加热溶解，pH自然。

1.2 仪器与试剂

Thermo Sorvall Biofuge Primo R型高速冷冻离心机（美国Thermo公司）；TaKaRa TP600型PCR仪（日本TaKaRa公司）；Applied Biosystems 3730-XL型测序仪（美国Applied Biosystems公司）；Tanon 2500型凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）；FD-1A-50型冷冻干燥机（北京博医康实验仪器公司）；AUW220D型电子天平（日本岛津公司）。

AxyPrep基因组DNA小量制备试剂盒AP-MN-BT-GDNA-50（美国Axygen公司）；DNA凝胶回收试剂盒（美国Axygen公司）；Taq DNA聚合酶（上海桑尼生物科技有限公司）；DNA Marker（日本TaKaRa公司）；葡萄糖、蛋白胨、琼脂均为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 桑黄菌种的分离 取子实体内部生长点，接种至PDA平板培养基，分离母种，28 ℃培养。取乳黄色菌丝转接至PDA斜面培养基，28 ℃培养至菌丝满管，置4 ℃保存。

1.3.2 桑黄菌种的鉴定 取分离菌种，提取基因组DNA，进行PCR扩增，采用内转录间隔区序列（ITS）分别对样品进行分子鉴定。提取基因组DNA，进行PCR扩增。引物设计，ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGC，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒回收。取纯化后的PCR产物，使用测序仪进行DNA测序[5-7]。

1.3.3 桑黄生长测定 取母种，接种至平板或斜面培养基，28 ℃培养，观察记录菌丝生长速度和浓密程度。菌丝生长速度=（菌落的直径-菌种块直径）/2/菌落生长的时间。取母种，接种至液体培养基，250 mL三角瓶装液量100 mL，28 ℃，160 r/min，培养21 d。发酵液5 000 r/min离心后收集菌丝体，用水清洗3次，冷冻干燥后称重得菌丝体生物量[8，9]。

数据处理采用SAS 9.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 野生桑黄菌种的鉴定

桑黄原基呈柠檬黄或嫩黄色，子实体较大，菌盖表面黄棕色至棕色，多年生老熟子实体菌盖呈棕褐色，无菌柄，菌盖木质化，具有反复生长停顿形成的年轮状结构，呈扇形、马蹄形等。本研究中的野生桑黄采自40年左右老桑树根部，14 cm×12 cm，重220 g。经分离纯化后，得到菌种母种（图1）。采用测序仪对纯化后的PCR产物进行DNA测序，结果为：A。经美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库比对，与菌种FS656161相似度为99%，命名为Inonotus linteus，与裂蹄木层孔菌（Phellinus linteus）为同种异名[10]。桑黄及相似种类大多演化出与其寄主树木的专一性。世界上广泛误认为桑黄的学名为Phellinus linteus（现称Inonotus linteus），实际上此类桑黄分布于热带美洲和非洲，不在东亚地区，不长在桑树上。结合寄生数种、形态特征与分子鉴定，确定桑黄是分布于中、日、韩，仅生长于桑属（Marus）植物上的新种，学名应为Inonotus sanghuang，区别于Phellinus igniarius（火木层孔菌）、Phellinus linteus（裂蹄木层孔菌，现称Inonotus linteus）、Phellinus baumii（鲍氏针层孔菌，现称Inonotus baumii）、Phellinus vaninii（瓦尼针层孔菌，现称Inonotus vaninii）[11，12]。

2.2 桑叶提取物对桑黄生长的影响

2.2.1 MLE浓度对桑黄菌丝体生长的影响 采用不同浓度MLE、葡萄糖斜面培养基培养桑黄（表1）。不同浓度MLE对桑黄生长存在不同程度的影响，最佳添加浓度为0.5%，高于0.5%对桑黄生长存在抑制作用。不同浓度MLE培养基中添加2%葡萄糖可增加菌丝浓密程度。0.5% MLE组与2%葡萄糖-0.5% MLE组生长速度均为2.4 mm/d，没有显著差异，后者比前者菌丝浓密。

采用基础PDA培养基添加不同浓度MLE培养桑黄的结果见表2。由表2可知，MLE对桑黄生长有一定的促进作用，基础PDA培养基添加0.5% MLE，桑黄生长速度为3.5 mm/d，与基础PDA培养基组存在极显著差异。添加量高于0.5%对桑黄生长存在抑制作用。

2.2.2 桑叶提取物对桑黄生物量的影响 不同液体培养基培养桑黄生物量见表3。采用PDA培养基，菌丝体生物量为9.5 g/L，添加0.5%MLE，菌丝体生物量达到11.7 g/L。采用葡萄糖蛋白胨培养基，菌丝体生物量为5.9 g/L，添加0.5%MLE，菌丝体生物量达到10.6 g/L。由此可见，在常规培养基中添加MLE，对桑黄菌丝体生长具有一定的促进作用。

3 小结与讨论

桑叶是家蚕的主要饲料，含有粗蛋白、可溶性碳水化合物、维生素、多酚类物质、黄酮类物质、矿物质、生物碱、植物纤维等多种营养与生物活性成分，在药品和食品保健产业化开发方面有着广阔的前景。桑黄作为珍贵的药用真菌，已得到广泛认可，但由于桑黄生长需要较为特殊的自然气候环境，且生长期长，因而天然桑黄数量非常稀少。在湖北首次发现野生桑树桑黄，为进一步科学研究奠定了基础。经分离鉴定，结合文献资料，判定该野生桑树桑黄学名为Inonotus sanghuang[11，12]。

研究表明，不同浓度MLE对桑黄生长存在不同程度的影响，最佳添加浓度为0.5%。MLE培养基中添加2%葡萄糖可增加菌丝浓密。基础PDA培养基中添加0.5%MLE，桑黄生长速度为3.5 mm/d，与基础PDA培养基组存在极显著差异。采用PDA培养基，添加0.5%MLE，菌丝体生物量达到11.7 g/L。由此可见，在常规培养基中添加0.5%MLE，对桑黄菌丝体生长具有一定的促进作用，且菌丝体颜色较深，其中原因有待进一步研究。MLE对桑黄菌丝体的生长具有促进作用，对下一步桑黄人工栽培研究具有重要意义。

参考文献：

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