苗药痛风停对SD大鼠急性痛风性关节炎的影响
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【摘 要】目的：观察苗药痛风停对尿酸盐结晶诱导的sd模型大鼠急性痛风性关节炎的关节肿胀度、步态分级、滑膜病理、白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的影响，探讨苗药痛风停对急性痛风性关节炎的作用机制。方法：将60只SD大鼠随机分为空白对照组，苗药痛风停低、中、高剂量组，双氯芬酸钠组，模型对照组，每组10只。除空白对照组外，其余分别建立以尿酸盐结晶诱导的大鼠急性痛风性关节炎模型，分别观察和测量造模前及造模后6，12，24，48 h大鼠关节横径，并计算关节肿胀度；观察大鼠24，48 h步态分级；造模后48 h处死大鼠，用酶联免疫吸附法测定细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达。结果：各治疗组对大鼠关节肿胀度、步态分级、滑膜病理改变和IL-1β、IL-6、TNF-α的表达有不同程度的改善，苗药痛风停中、高剂量组与双氯芬酸钠组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。结论：苗药痛风停能够改善尿酸盐结晶诱导的SD模型大鼠急性痛风性关节炎关节肿胀度、步态分级及滑膜病理改变；苗药痛风停降低尿酸盐结晶诱导的SD模型大鼠细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α的表达，以中、高剂量作用明显，并呈剂量依赖性。
【关键词】 痛风性关节炎；细胞因子；苗药痛风停；尿酸盐；实验研究
doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.08.002
【ABSTRACT】 Objective：To observe the effect of Miao medicine Tongfengting （苗药痛风停） on joint swelling，gait grading，pathological change of synovium，and the expression of IL-1β，IL-6 and TNF-α of SD rats with acute gout arthritis induced by monosodium urate crystal in order to study the mechanism of action of the medicine on acute gout arthritis.Methods：60 SD rats were randomly divided into a blank control group，low，medium and high dose groups of Miao medicine Tongfengting，a diclofenac sodium group and a model control group，10 rats in each group.Apart from the control group，models of acute gout arthritis induced bymonosodium urate crystal were established.The joint transverse diameter of model rats was observed and the joint swelling was measured respectively after 6，12，24 and 48 hours.The model rats were killed after 48 hours to measure the expression of IL-1β，IL-6 and TNF-α.Results：The joint swelling，gait grading，pathological change of synovium，IL-1β，IL-6 and TNF-α of SD rats all had different degrees of improvement in each treatment group.The difference between the medium and high dose groups and the diclofenac sodium group was not statistically significant （P > 0.05）.Conclusion：Miao medicine Tongfengting can improve the joint swelling，gait grading and pathological change of synovium and lower the expression of IL-1β，IL-6 and TNF-α which was obvious and dose dependent in the medium and high dose groups.
【Keywords】gout；cytokine；Miao medicine Tongfengting（苗药痛风停）；monosodium urate；experimental study
痛风（gout）是体内嘌呤代谢紊乱及/或排泄减少导致尿酸盐（monosodium urate，MSU）沉积所引起的晶体性关节病。痛风在我国的患病率约为0.15%～0.67%，较以前有明显升高[1]。痛风性关节炎常常合并有心血管疾病、高血压、2型糖尿病、肥胖、高脂血症、代谢综合征、慢性肾脏疾病和肾结石等[2]，而这些合并症往往是NSAIDs和/或秋水仙碱常见的禁忌症[3]。细胞因子白细胞介素IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等的高表达可导致、加重MSU结晶诱导的急性炎症的发生和发展[4]。中医学对痛风治疗有深入的认识，积累了丰富的临床经验。苗药痛风停根据中医理论和苗医理论对痛风认识的结合而遣方组药，由白虎加桂枝汤加减苗药组成，通过本课题组多年临床观察、临床研究和实验研究，其治疗急性痛风性关节炎疗效显著，安全性好，缓解痛风性关节炎效果明显，并具有降尿酸作用[5-7]。在前期实验研究中，笔者已经证实苗药痛风停能够抑制SD大鼠急性痛风性关节炎IL-8、环氧化酶-2（COX-2）的表达，减轻关节滑膜炎症[8-9]。本文旨在探讨苗药痛风停对IL-1β、IL-6和TNF-α的影响。
1 实验材料
1.1 实验动物 清洁级健康雌雄SD大鼠60只，体质量（200±20）g，由重庆滕鑫生物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（渝）2014-0009。
1.2 主要试剂及仪器 尿酸钠（美国Sigma公司，批号BCBH7155V）；吐温80（美国Amresco公司，批号20090120）；多粘菌素B（美国Amresco公司，批号2013105156）；氨基酸乙脂（上海伊卡生物技术有限公司，批号EK131219）；质量分数为4%的多聚甲醛溶液（上海博谷生物科技有限公司，批号PT028）；IL-1β ELISA检测试剂盒（上海研辉生物科技有限公司，批号CK-E30419R）；IL-6 ELISA检测试剂盒（上海研辉生物科技有限公司，批号CK-E30646R）；TNF-α ELISA检测试剂盒（上海研辉生物科技有限公司，批号CK-E30635R）；酶标仪（美国BioTek有限公司，批号Synergy TM）；显微镜（日本OLYMPUS公司，批号BX51T-PHD-J11）；CMOS（日本OLYMPUS公司，批号BX51T-PHJ-D17）；切片机（德国Leica公司，批号RM2015）；冷冻离心机（北京离心机厂，批号LDZ5-2型）；电子天平（瑞士METTER，批号AE100型）；低温冰箱（日本SANYO公司，批号MDF-382E型）；电子游标卡尺：贵阳中医学院基础实验室提供。
1.3 实验药物 苗药痛风停由生石膏15 g、知母12 g、黄柏12 g、川萆Z10 g、薏苡仁12 g、砂仁12 g、川牛膝15 g、甘草6 g等，加苗药观音草12 g、芭蕉根12 g、络石藤15 g、大血藤15 g等组成。以上生药均购于贵阳中医学院第二附属医院。取上药煎汤浓缩，质量分数按实验需求的低、中、高分组分别浓缩至1.54，3.08，6.16 g・mL-1，置于4 ℃冰箱保存。双氯芬酸钠缓释片（四川花新制药有限公司，批号H19991402），临用时将药片充分研磨后用无菌蒸馏水配制成混悬液，然后配制成1.54 mg・mL-1的混悬液备用。
2 方 法
2.1 实验动物分组 将60只SD大鼠随机分为空白对照组，苗药痛风停低、中、高剂量组，双氯芬酸钠组，模型对照组，每组10只。
2.2 造模方法 将大鼠步态分级[10-11]作为各组SD大鼠的筛选标准，未达到0级标准的SD大鼠则剔除不用。具体造模方法：依据Mc Carty DJ[12]的经典造模方法，先用质量分数为20%的乌拉坦（5 mL・kg-1）腹腔注射麻醉，然后常规消毒大鼠右侧膝关节皮肤，稍弯曲膝关节，从关节正中或侧方用6号注射针进针，将尿酸钠溶液10 mg（0.4 mL）及多粘菌素B 0.1 mL（10 U・mL-1）注入大鼠膝关节腔，空白对照组予相同剂量的生理盐水关节腔注射。整个实验过程中，有3只大鼠因灌胃不当死亡，2只大鼠因麻醉过深死亡，为保证样本数量，及时填补。
2.3 给 药 各组SD大鼠在相同条件下自由饮食1周后，开始灌胃。根据成人与大鼠用药等效剂量换算，中剂量等于将成人用药剂量换算为大鼠用药剂量，中剂量减半则为低剂量，中剂量加倍则为高剂量。苗药痛风停低、中、高剂量组分别按质量分数不同每只灌胃2 mL，即低、中、高剂量组分别为每只1.54，3.08，6.16 g・d-1；双氯芬酸钠组灌胃剂量每只2 mL，即每只2.08 mg・d-1；空白对照组及模型对照组予以等体积的生理盐水灌胃。各组大鼠连续灌胃3 d及造模前1 h进行灌胃，每日1次。最后一次灌胃后1 h，按上述造模方法造模。造模后继续给药，每日1次，直至大鼠处死。
2.4 标本取材 将大鼠用质量分数为20%的乌拉坦（5 mL・kg-1）腹腔注射麻醉后，股动脉放血约4～6 mL，静置约1 h后，以2500 r・min-1速度离心30 min，分离血清，用于ELISA检测。大鼠放血后，将其处死，进行常规消毒，沿后肢右膝关节正中纵行剪开皮肤，暴露出膝关节，打开膝关节腔，用眼科剪取完整的关节滑膜组织，用PBS水清洗去除血迹后，置于1.5 mL预冷的离心管中，然后加用质量分数为4%的多聚甲醛约1 mL固定，迅速冻存在-80 ℃冰箱中。
2.5 检测指标 关节肿胀度：分别于造模前，造模后6，12，24，48 h用电子游标卡尺在同一部位测定膝关节横径，造模前后的差值作为关节肿胀度。大鼠步态分级：按Coderre等[11]的方法观察大鼠步态，0级，正常；1级，轻微跛行，受试下肢略有弯曲；2级，中度跛行，受试下肢刚触及地面；3级，重度跛行，受试下肢离开地面，三足着地行走。在造模后12，24 h评价大鼠步态分级。病理学检测采用HE染色，先用质量分数为4%的多聚甲醛固定组织，石蜡包埋、切片。HE染色的主要步骤如下：先用二甲苯脱蜡，无水乙醇水化，苏木素染色，盐酸酒精分化，伊红染色；之后用酒精将伊红洗掉，以酒精梯度脱水中性树胶封片后光镜下观察滑膜组织病理变化。ELISA检测血清中IL-1β、IL-6和TNF-α表达（具体操作方法按说明书进行）。
2.6 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料以表示，如果符合正态分布和方差齐性，不同组间比较采用One-Way ANOVA分析；方差齐性时用LSD法检验，方差不齐性时用Tamhance's T2法检验；如果不符合正态分布，则使用非参数检验；等级资料采用Kruskal-Wallis H及Mann-Whitney U检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 各组大鼠关节肿胀度比较 造模后6 h，与空白对照组比较，各组关节肿胀度均不同程度升高，差异有统计学意义（P < 0.01）。造模后12 h，与空白对照组比较，各组关节肿胀度继续升高，差异有统计学意义（P < 0.01）；与模型对照组比较，各治疗组关节肿胀度差异有统计学意义（P < 0.01）；与双氯芬酸钠组比较，苗药痛风停低、中、高剂量组关节肿胀度差异无统计学意义（P > 0.05）。造模后24 h，各组关节肿胀度继续升高，其中模型对照组关节肿胀度达到最高峰，与空白对照组比较，各组关节肿胀度差异均有统计学意义（P < 0.01）；与模型对照组比较，各治疗组关节肿胀度差异有统计学意义（P < 0.01）；与双氯芬酸钠组比较，苗药痛风停中、高剂量组关节肿胀度差异无统计学意义（P > 0.05）；苗药痛风停低剂量组关节肿胀度差异有统计学意义（P < 0.05）。之后各组大鼠关节肿胀开始下降，造模后48 h，模型对照组关节肿胀度继续下降，与空白对照组比较，差异仍有统计学意义（P < 0.01）；与模型对照组比较，双氯芬酸钠组，苗药痛风停中、高剂量组关节肿胀度下降明显，差异有统计学意义（P < 0.01），苗药痛风停低剂量组关节肿胀度差异无统计学意义（P > 0.05）；与双氯芬酸钠组比较，苗药痛风停中、高剂量组关节肿胀度差异无统计学意义（P > 0.05）；与苗药痛风停高剂量比较，中剂量组关节肿胀度差异无统计学意义（P > 0.05）；与苗药痛风停低剂量组比较，中剂量组关节肿胀度差异有统计学意义（P < 0.01）。见表1。
3.2 各组大鼠步态分级比较 大鼠步态分级统计采用多个独立样本的非参数检验，造模后24 h，观察各组大鼠步态，总体样本差异有统计学意义（χ2 = 29.800，P < 0.01）；与空白对照组比较，各造模组差异有统计学意义（P < 0.01）；与模型对照组比较，各治疗组差异有统计学意义（P < 0.01）；各治疗组之间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。经造模后48 h，总体样本差异无统计学意义（χ2 = 5.102，P > 0.05），说明48 h后各组大鼠跛行步态逐渐缓解。见表2。
3.3 滑膜组织病理学形态改变 HE染色后，空白对照组关节滑膜组织光滑完整、无增生，可见少量炎性细胞浸润、无血管增生及纤维素渗出；苗药痛风停各剂量组及双氯芬酸钠组滑膜组织充血水肿，成纤维细胞增生，炎性细胞浸润减少，程度比模型对照组减轻；模型对照组滑膜充血水肿、周围毛细血管扩张，大量炎性细胞浸润，主要为中性粒细胞。滑膜病理学显示，苗药痛风停不同剂量均能减轻滑膜组织充血水肿及毛细血管扩张，炎性细胞浸润，减轻滑膜病理损害，从而减轻炎症反应。见图1。
3.4 各组大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α表达情况 ELISA检测结果显示，IL-1β、IL-6和TNF-α表达量均增高，与空白对照组比较，模型对照组差异有统计学意义（P < 0.01）；与模型对照组比较，各治疗组IL-1β、IL-6和TNF-α的表达量均有下降，差异有统计学意义（P < 0.01）；与双氯芬酸钠组比较，苗药痛风停中、高剂量组差异无统计学意义（P > 0.05）；与苗药痛风停高剂量组比较，中剂量组差异无统计学意义（P > 0.05），低剂量组差异有统计学意义（P < 0.01）。见表3。
4 讨 论
IL-1β是最经典的炎症调节剂，是调节炎症的始动因素，在痛风性关节炎中，活化的IL-1β能调节其他细胞因子和炎症趋化因子，募集中性粒细胞进入MSU结晶沉积部位，放大炎症反应，从而加重关节炎症[13]。IL-1β是痛风性关节炎发病过程中的关键因子，在急慢性痛风性关节炎中起重要作用，对痛风性关节炎的形成和关节破坏发挥重要作用[14]，采用IL-1抑制剂治疗痛风性关节炎取得了满意的临床疗效[15]。IL-6也参与了痛风的发生发展，当痛风性关节炎等病情活动或关节破坏严重时，血清与关节液中IL-6的水平升高，IL-6作为判断痛风性关节炎疾病活动性和严重程度的指标[16]。MSU晶体使滑膜细胞和单核细胞生成IL-6增加。最新研究显示，托珠单抗治疗痛风性关节炎后患者血清IL-6降低，痛风石大小有所减小，不发热，在此过程中患者没有急性痛风性关节炎的发作[17]。TNF-α是炎性细胞因子网链中的第1个细胞因子，不仅启动炎症反应，而且能诱导其他细胞因子如IL-1β、IL-6、IL-8等炎症细胞因子的过度表达，导致炎症反应进一步扩大[18]。在MSU晶体诱导的痛风模型中，如果阻断TNF-α的产生，则E-选择素的表达和中性粒细胞的募集明显地受到抑制，证明了TNF-α在痛风性关节炎的发病中发挥重要作用。TNF-α抑制剂对于复杂的痛风性关节炎能够有效缓解临床症状，并且抑制MSU的继续沉积[19]。中医学认为，痛风的发病机制主要是饮食不节，过食肥甘厚味、辛辣之品，加上外感风寒湿邪气，损伤脾胃，脾失健运，湿浊内滞，聚于关节，湿聚成痰，痰湿为有形之邪，痹阻日久，气血运行不畅，则生瘀血，痰湿与瘀血互结阻滞脏腑经络气血津液运行，机体代谢紊乱，则发为痛风。痰湿与瘀血互结则痛风长期不愈，反复发作。苗医认为，疾病是由不良的生存环境、季节气候因素和外来毒素（如风毒、气毒、寒毒、水毒）等引起人体的损伤。苗药痛风停由经方白虎加桂枝汤加减苗药观音草、芭蕉根、络石藤、大血藤等组成，综观全方共奏清热解毒、健脾利湿、活血化瘀之效。
本实验采用ELISA检测显示，与空白对照组比较，模型对照组差异有统计学意义（P < 0.01），说明造模是成功的，各治疗组IL-1β、IL-6和TNF-α表达均有所下降，以苗药痛风停中、高剂量组显著。各造模组大鼠关节肿胀度在造模后6 h开始肿胀，12 h后继续升高，24 h达到高峰，48 h后逐渐缓解，在造模后12 h，各治疗组关节肿胀明显低于模型对照组（P < 0.01），在24 h和48 h分别表现出以苗药痛风停中、高剂量组缓解明显。而各组大鼠步态分级则以24 h模型对照组明显，出现中、重度跛行，各治疗组跛行程度较轻，48 h后基本缓解，苗药痛风停可明显缓解大鼠关节肿胀度和步态分级。通过病理学观察显示，各治疗组滑膜组织充血、水肿，炎症细胞浸润较模型对照组减轻，说明苗药痛风停能够改善滑膜病理损害，减轻炎症反应。综上所述，笔者推测苗药痛风停对MSU诱导的SD大鼠急性痛风性关节炎的改善可能是通过抑制下游细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达减轻炎症反应而实现的，并呈现出剂量依赖性。
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收稿日期：2015-05-03；修回日期：2015-06-15