猪皮胶原分离

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引 言

胶原广泛存在于动物体的皮肤、肌腱、韧带、软骨等结缔组织中，是细胞外基质 4 大组分之一，属于一种结构蛋白质。胶原是哺乳动物体内含量最高的蛋白质，占体内蛋白质总量的25% ～ 30%［1 －2］。由于具有独特的三股螺旋结构，赋予了胶原良好的生物相容性、弱抗原性、可降解性等生物学功能。胶原应用于医学材料领域具有得天独厚的条件，如具有良好的生物相容性、较弱的抗原性、亲水性好、利于细胞的粘附，促进细胞生长等［3］。正是由于胶原的应用广泛，作为生物医用材料的潜力巨大，胶原的分离纯化成为了众多学者研究的热点。胶原的结构较为复杂，且不溶于水，导致从动物组织中纯化较为困难。如果胶原中无机盐含量过高，不仅影响纯度，还将会影响其作为止血材料的性能，对创面造成不良的影响［4］。胶原的分离纯化主要有以下特点: 胶原作为一种蛋白质，是具有生物活性的物质，在分离纯化过程中，有机溶剂、溶液 pH 值、环境温度、离子强度的变化等，均可使蛋白质变性失活; 原料的组成非常复杂; 作为医用的生物材料，所要求的产品必须是高度纯化的，且无菌、无致热源等［5］。应用色谱法分离纯化生物大分子，效率高，选择性好。其中又主要以包括凝胶色谱等液相色谱为主［6］。凝胶色谱又叫凝胶层析或凝胶过滤色谱，是混合物随流动相经固定相( 网状孔径) 的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术，通过蛋白质分子大小不同实现分离的。孔径比凝胶大的分子不能进入凝胶内网状结构，而被排阻于凝胶之外，随着溶剂在凝胶之间的空隙向下移动并最先流出柱外; 比网孔小的分子可渗透进入凝胶颗粒内部，再扩散出来，经历的流程长，流动速度慢，后流出［7］。与其他的色谱法相比较，凝胶色谱有其自身的优点，如凝胶过滤的介质价廉易得、可重复再生、溶质与介质不发生相互作用等，适合于规模化的分离纯化。因而在生物大分子分离纯化过程中应用最普遍，尤其是在分离纯化初级阶段及成品化前的脱盐工序被广泛应用［8］。本研究对凝胶色谱法分离纯化胶原进行了探索和试验，通过紫外分光光度计检测收集样品的吸光值的变化趋势，结合电导率的走向，分析胶原的分离效果和除盐效果，为胶原规 模 化 的 分 离 纯 化 奠 定 一 定基础。

1 材料与方法

1． 1 主要试剂与仪器

纯化猪皮［9］，经过一系列物理化学与生物方法处理，除去脂肪、毛发等杂质成分实验室自制而得;葡聚糖凝胶，Dextran Gel G － 25( 粒度 100 － 200 目) ，中 国 长 征 制药厂;牛腱 I 型胶原( 生化级) ，Sigma 公司;三羟甲基氨基甲烷( BR) 、氯胺 T( AR) ，成都科龙化工试剂厂;冰乙酸( AR) ，重庆申渝化学试剂厂;硫酸铵( AR) ，重庆茂业化学试剂有限公司;对二甲氨基苯甲醛，天津新纯化学试剂研究所。精密 pH 计，PHS － 3B，上海雷磁仪器厂;电导率仪，DDS － 307，上海雷磁仪器厂;磁力搅拌器，84 －1A;电子天平，FA2004N，上海箐海仪器有限公司;层析柱，成都蜀都化验设备厂;微量移液器，上海荣泰生化工程有限公司;冷冻干燥机，Freeze 6，Labconca;紫外可见分光光度计 UV751GD，上海分析仪器总厂;傅里叶变换红外光谱仪，NicoletiS10，美国 Thermo Fisher。

1． 2 试验方法

1． 2． 1 凝胶色谱法分离胶原

1． 2． 1． 1 凝胶的预处理

称取适量葡聚糖凝胶 G － 25，加入蒸馏水中; 沸水加热溶胀，然后用浮选法除去小颗粒和碎片。

1． 2． 1． 2 凝胶的装柱

选用柱高 20cm，内径 6cm 的层析柱，排除死体积内气泡，溶胀好的凝胶与洗脱液混合后，缓慢加入到柱体内，将其垂直固定，少量洗脱液冲洗管壁，稳定下沉。

1． 2． 1． 3 粗提胶原的制备

纯化猪皮剪碎，经三羟甲基氨基甲烷 － 氯化钠缓冲溶液浸泡直至皮块稍微溶胀，倾去缓冲液，调节 pH 值 2．5，2% 胃蛋白酶，4℃ 条件下反应 8h( 皮块基本水解完全) ，抽滤得清液，调节 pH 值至 7． 5，硫酸铵盐析，得到胶原粗提物，上样时做适当的稀释。

1． 2． 1． 4 上样

打开柱底出口，放洗脱液至胶床面齐，关闭下口，取稀释后的胶原溶液样品 5mL，使移液管尖端慢慢地沿着管壁，将样品放入床内，再用少量洗脱液冲洗管壁 2 次，保留液面 2 ～ 3mm时开始上样。

1． 2． 1． 5 洗脱、收集样品

每 4mL 收集一管，共收集 30 管。

1． 2． 2 透析方法纯化胶原

将盐析处理的胶原盐溶液过滤，加入适量 0． 2mol/L 醋酸溶液溶解，将此胶原溶液装入透析袋( 截流分子质量 14kDa) ，对 0． 04mol/L 和 0． 02mol/L 的 Na2HPO4溶液各透析 1d，蒸馏水透析 2d，经常换液( 整个透析过程于4℃ 下进行) 。完成后，将透析袋内的样品均匀转移至干净的培养皿中冷冻干燥( 2d，－ 37℃ 真空冷冻干燥) ，得海绵状胶原固体。

1． 2． 3 样品的性能检测

1． 2． 3． 1 紫外检测

将收集的样品于 225nm 处测定吸光值，以管号为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制洗脱曲线。

1． 2． 3． 2 电导率测定

测定收集到的样品的电导率，以管号为横坐标，电导率为纵坐标，绘制电导率变化趋势图。

1． 2． 3． 3 傅里叶变换红外光谱检测

红外光谱的形成是以分子的振动为基础，而这些振动可以定位到分子殊的键和基团［10］。因此可以通过红外检测手段对分离样品进行二级结构的表征，检测出胶原特有基团的特征吸收峰。收集到的吸收峰段的试样在 －37℃ 下，真空冷冻干燥 2d。制样采用溴化钾压片，进行检测时扫描波数为450 ～ 4 000cm－ 1，分辨率为 2cm－ 1，每次扫描重复 16 次。

1． 2． 3． 4 羟脯氨酸含量的测定

准确称取羟脯氨酸标准品，加入少许 0. 001mol/L 盐酸溶液，配制浓度分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9 和10mg/L的羟 脯 氨 酸 标 准 液，待 用。以 0．001mol /L 盐酸溶液为空白液，于 2mL羟脯氨酸标准液和空白液中加入 1mL氯胺 T 溶 液，混 合 均 匀，室 温 静 置20min; 加入过氯酸溶液 1mL，室温静置 5min; 加入对二甲氨基苯甲醛溶液1mL，混合均匀; 60℃ 保温 20min 后，立即置于水中冷却; 测定在 560nm 处的吸光值; 以羟脯氨酸含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。取 0． 5mL 样品溶液和 0． 5mL 盐酸至安醅瓶( 另取 0． 5mL 蒸馏水和 0．5mL 盐 酸 作 空 白 对 照) ，封 管 后 于120℃ 加热 6h 进行水解。调节 pH 值至 4 ～ 6，定容至 25mL 待用。样品的羟脯氨酸含量测定操作方法同标准液的测定方法。

2 结果与讨论

2． 1 紫外分析和电导率分析

试验及文献［11］表明，胶原溶液在225nm 处有强烈的吸收峰，故试验收集样 品 在 225nm 处 检 测 吸 光 值，225nm 处测得吸光值及电导率的变化如图 1 所示。由图 1 可以看出: 在 225nm 处的吸光值先是非常平缓，因为首先流出来的洗脱液中既没有盐也没有溶解的胶原分子，故吸光值较低，且都处在同等水平; 然后吸光值急剧上升到一个平台，保持在一定的水平，说明此刻已经有物质从凝胶色谱柱系统中流出，此物质即为胶原。胶原是大分子物质，不会进入凝胶内部的网状结构，被排阻于凝胶之外，所以会先流出柱体;由于上样量是一定的，当然体系中胶原分子也是一定的，随着胶原逐渐的流出，吸光值也会下降。因此，在出现平台之后，曲线又急剧下降到一定程度，趋于平缓。但是此时的吸光值比初始的吸光值高，说明有一些小分子蛋白的流出，同时开始有盐的流出，这点从电导率的曲线急剧上升可以明显看出。硫酸铵盐是小分子物质，能进入到凝胶内部，渗透进凝胶颗粒的网状结构，故流出较胶原大分子慢。用氯化钡溶液检测硫酸铵盐的存在，结果发现直到第 27 管开始才有沉淀析出，这点与电导率的变化是一致的，进一步证实了之前吸光值变化的结果。由以上分析初步断定第 17 －20 管( 即吸光值变化曲线平台段) 收集的样品为胶原溶液，且没有盐分的存在。

2． 2 红外光谱分析

通过红外光谱的检测，可以反映物质的分子结构，图谱中的吸收峰与分子中的各个基团的振动形式相对应，因此可以得到试样的官能团化学键的基本信息。酰胺Ⅰ带的特征吸收位于 1 600 ～1660cm－ 1左右，是由羰基的伸缩振动引起的强烈吸收。文献［10］表明，α － 螺旋的酰胺Ⅰ带吸收波数范围在 1 650 ～ 1658cm－ 1处。酰胺Ⅱ带的特征吸收峰在1 550cm－ 1附近，与 N—H 弯曲振动和C—N 伸缩振动有关。位于 1 220 ～ 1 330cm－ 1区域的吸收归属于酰胺Ⅲ带，酰胺Ⅲ带的振动能明显区分 α － 螺旋与无规则卷曲这 2种二级结构。另1 450cm－ 1附近的吸收峰是由 C—H 的弯曲振动引起。图 2 中 a 和 b 是凝胶色谱分离得到胶原样品和常规透析方法得到的胶原的红外光谱图，图 3 为 SigmaⅠ型胶原的红外图谱，各吸收峰的归属情况见表1。比较3 条红外图谱可以发现:不论是凝胶色谱分离胶原还是常规透析法制得的胶原，均与 SigmaⅠ型胶原有相似的主要吸收峰。据文献［12］表明，于1 235 ～1 450cm－ 1范围的吸收峰可以表明胶原的三股螺旋结构的存在。图 2a 中波数为 1 239. 37、1 338. 98 和1 404. 83cm－ 1等处存在吸收峰，图2b 中1 240. 8、1 338. 6 和 1 402. 5cm－ 1等处，也同样明显存在吸收峰，图 3 中1 239. 58、1 337. 35、1 402. 49cm－ 1等处存在吸收峰。3 条图谱中在 1 235cm－ 1和1 450cm－ 1附近的吸收峰的吸光度比值均在 0. 9 以上，较接近Ⅰ型胶原特征值1．0，而不是同等条件下的变性胶原和明胶的 0. 59［12］。因此，由红外光谱分析可初步认为凝胶色谱法分离的胶原基本保持了三股螺旋的结构，且与同等条件下常规透析方法纯化得到的胶原和 Sigma 公司的Ⅰ型胶原类似。

2． 3 羟脯氨酸含量分析

羟脯氨酸是胶原的一种特征氨基酸，通过检测溶液中羟脯氨酸的含量，可以较好地反映胶原含量及纯度，按照 Woessner 法( 第 I 法)［13］测定羟脯氨酸 含 量，此 法 操 作 简 单，且 重 复性好。根据此方法测得羟脯氨酸含量为8． 02% ，与文献值［14］7% ～ 14% 接近，基本符合羟脯氨酸在胶原中所占的比例，表明所分离得到的胶原样品的纯度较高，可初步判定应属于 I 型胶原。对于采用凝胶色谱法分离得到的猪皮胶原的结构的分析，还需要进一步通过电泳法，氨基酸全分析、圆二色谱法和原子力显微镜等检测手段加以确证。

3 结 论

葡聚糖凝胶 Sephadex G －25 较适用于蛋白质的脱盐操作，洗脱曲线中能见明显的洗脱峰，分离效果较好。对分离的样品进行适当地表征，结果表明分离样中胶原基本上保持了其三股螺旋的特征结构，初步判定属 I 型胶原范畴。