丁香精油的安全性评价
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【摘 要】目的：建立丁香精油的安全性评价方法。 方法：以丁香酚为指标采用气相色谱法对丁香精油进行含量测定，并分别从急性皮肤刺激试验，多次皮肤刺激试验，眼刺激试验几个方面对其安全性进行分析。结果：丁香酚在0.0997～1.9940 mg/ml 浓度范围内具有良好的线性关系，平均回收率为99.01%，RSD为1.89%（n=6）。急性皮肤刺激试验和眼刺激试验在50%的浓度范围内，丁香精油强度显示为无刺激，多次皮肤刺激试验中，丁香精油浓度在75%和100%时属于轻度刺激性。结论：气相色谱法灵敏、简便， 结果准确可靠， 可作为控制丁香精油质量的方法。丁香精油对动物皮肤和眼睛的刺激性较小。
【关键词】丁香精油；丁香酚；安全性评价；含量测定
【文章编号】1004-7484（2014）07-4156-02
【Abstract】Objective：To develop a method of safety assessment for Clove essential oil. Methods：the content of Clove essential oil was determined by GC with eugenol as a quantitative indicator and its safety was evaluated by the use of acute skin irritation test， multiple skin irritation and eye irritation test. Results：The linearity of eugenol content was good when its concentration was in the range between 0.0997～1.9940 mg/ml， the average rate of recovery was 99.01%， RSD was 1.89%（n=6）. With regard to acute skin irritation test and eye irritation test， Clove essential oil was nonirritant at a concentration of 50%. In the multiple skin irritation， Clove essential oil was mild irritant at concentrations of both 75% and 100%. Conclusion：The GC method is fast， simple， accurate and suitable for quality control of Clove essential oil. Clove essential oil is mild irritant for eyes and skin of animal.
【Keywords】Clove essential oil， Eugenol， Safety assessment， Determination of content
丁香为桃金娘科植物丁香（Eugenia caryophyllata Thun.的干燥花蕾。其味辛、性温，具有温中将逆、补肾助阳的功效，可用于治疗脾胃虚寒、呃逆呕吐、食少吐泻、心腹冷痛、肾虚阳痿等症。丁香中主要含有机酸类、苷类和挥发油类等有效成分。丁香花蕾中含挥发油 15%～20%，丁香酚（Eugeno1）即4一烯丙基2一甲氧基苯酚，属有机酸酚类，广泛存在于丁香油、肉桂叶油、肉桂皮油、樟脑油、肉豆蔻油等芳香油中。丁香酚药理作用广泛，具有抑菌、镇痛麻醉、解热、抗氧化、促进透皮吸收、祛蚊等多种药理活性。丁香酚最初在口腔医学中主要用于镇痛安抚。随着新的药理作用不断被研究发现，丁香酚在药品、食品、化妆品中的应用越来越广泛。
丁香均为海南常见的芳香类药物，在各个领域应用比较广泛，目前主要研究在规范化栽培种植、有效成分的提取分离和结构鉴定、精油的提取工艺、产量、成分、香气特征等方面，对精油的安全性评价较少，本研究采用气相色谱法对其精油主要成分进行监控，并进行方法学验证，并分别从精油的经口毒性、急性皮肤刺激、多次皮肤刺激以及眼刺激有关其安全性问题进行研究。以期为今后我省的芳香类药物的实际应用提供理论依据 。
1 仪器、试药与材料
1.1 仪器
Agilent Technologies 7890A 气相色谱仪。
1.2 试药
样品：丁香精油（自提，参照《中华人民共和国药典》（2010年版一部）挥发油提取方法，用挥发油提取器提取样品所得。
对照品：丁香酚，购自中国药品生物制品检定所（批号：110725-201213），经标化其含量为99.7%。
其它试剂：正己烷，分析纯。
1.3 材料
试验动物：健康新西兰兔，体重 2.0～ 2.5kg， 雌雄各半，由长沙市开福区东创实验动物科技服务部提供。
试验材料：马克笔，医用剪刀，棉球棒，医用脱脂棉，放大镜。
2 方法与结果
2.1 含量测定
2.1.1 溶液的配制
对照品储备溶液：精密称取丁香酚对照品500 mg，置10 ml容量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀。再精密吸取1 ml置25 ml容量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀，即得。
对照品溶液：精密吸取对照品储备溶液2 ml置10 ml容量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液：取本品约 50 mg， 精密称定，置25 ml容量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀，即得。
2.1.2 色谱条件的选择与系统适用性试验
参考文献，初定色谱条件如下：DB-WAX（ 30m ×320μm×0.25μm ）， 聚乙二醇（PEG）-20M为固定相，涂布浓度为10%； FID检测器；程序升温， 起始温度90℃， 保留3min，以速率 15℃/min 升至170℃，保留5min，最后以20℃/min 升至240℃，保留4min； 进样口温度为230℃，检测器温度为250℃； 载气为高纯氮气，流速为2.0ml/min；分流进样，分流比 50：1；进样量1μL。
按上述色谱条件，取空白溶剂、丁香酚对照品溶液与供试品溶液各1μl，分别注入色谱仪，记录色谱图，结果显示，丁香酚峰与相邻峰分离度为3.03，拖尾因子为1.03，丁香酚与相邻的杂质峰完全分离，但所用时间过长。
将程流速改为2.5ml/min，其余条件保持不变，测得丁香酚峰分离度为3.21，拖尾因子为1.0，理论塔板数以丁香酚峰计约为30000，结果显示，丁香酚峰与相邻的杂质峰能够完全分离，且峰形较好
2.2.2 多次皮肤刺激试验
选用皮肤完好的健康新西兰白兔为试验动物，然后进行随机分组，每组4只，雌雄各半。将丁香精油分别用基础油（霍霍巴油）稀释成不同的浓度，每个浓度对应一组动物。实验动物前处理以及精油涂抹方法与急性皮肤刺激试验相同，但每只动物每天要进行1次涂抹，然后在相同的时间段内连续涂抹14d，每天观察涂抹部位皮肤反应，连续观察14d并做好记录。结果评分与判定同“2.2.1”，结果见表7。
急性眼刺激实验中，受试动物眼睛偶尔勉强可见结膜充血，但无分泌物出现，也没有出现流泪及搔抓眼部等异常情况。如表8所示，在50%的精油浓度下，丁香精油眼刺激反应评分小于0.49，按眼刺激强度评价标准在精油浓度50%范围内属于无刺激性。
3 讨论
3.1 本文采用程序升温法进行含量测定， 与恒温法相比， 能使柱温与组分的沸点相互对应， 以使低沸点组分和高沸点组分在色谱柱中都有适宜的保留，具有改进分离、改善峰形、降低检测限及省时等优点。
3.2 本文采用外标法测定丁香酚的含量，简单，快捷，但进样量要求十分准确，要严格控制在与标准物相同的操作条件下景象，否则容易造成分析误差，得不到准确的测量结果。同时，外标物与被测组分同为一种物质但要求它有一定的纯度，分析时外标物浓度与被测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性。
3.3本次动物实验研究结果表明，丁香精油无眼刺激性，在多次皮肤刺激试验中，丁香精油的浓度在50%时属于无刺激；丁香精油浓度在75%和100%时，第14天的观察结果均为轻度刺激性。所以在生产或使用过程中，丁香精油与皮肤的接触可能会带来不明显的刺激，应注意其使用浓度，而对人体的安全性影响将需要进一步深入开展相关研究。
4 结论
所建立的含量测定方法快速、准确、可排除其它成分的干扰、重现性好，可用于丁香精油中丁香酚的含量测定； 急性皮肤刺激试验和眼刺激试验在50%的浓度范围内，丁香精油强度显示为无刺激，多次皮肤刺激试验中，丁香精油浓度在75%和100%时属于轻度刺激性。
参考文献
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