渐进延长后适应通过MAPK途径减轻再灌注损伤
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DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2013.08.012
基金项目：国家自然科学基金（30740080）；总医院院长青年基金（2011Q08）
作者单位：250031济南，总医院心内科（张国明、李晓燕、许琳），超声科（孙媛媛）；总医院老年心血管病研究所（王禹），心内科（李天德）
通信作者：孙媛媛，Email：
【摘要】目的探讨后适应不同模式对大鼠急性心肌缺血-再灌注损伤的影响，并进一步研究丝裂原活化蛋白激酶途径（MAPK）在其中的作用。方法60只SD大鼠随机（随机数字法）分为假手术组（Sham）、缺血-再灌注组（I/R）、渐进缩短后适应组（GDR， 后适应处理方案短暂再灌注/缺血时间为30/10—25/15—15/25—10/30s）、标准后适应组（ER，后适应处理方案为20/20s×4）和渐进延长后适应组（GIR， 后适应处理方案短暂再灌注/缺血时间为10/30-15/25-25/15-30/10 s）5组，建立急性心肌梗死和缺血后适应模型。再灌注6 h后每组取3只处死，取心肌组织用Western Blot方法测定磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶（P-ERK）、磷酸化应激活化蛋白激酶（stress activated protein kinase， P-JNK）、磷酸化p38 MAPK（P-p38）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8（Caspase-8）在心肌组织中的表达及细胞色素c在胞浆中的表达；各组其余大鼠再灌注24 h后测定血流动力学，抽血测心肌酶，取心脏进行TUNEL凋亡检测。统计学多组间比较应用单因素方差分析，组间差异两两比较应用q检验。结果三种后适应处理组均有显著的心肌保护作用 （P
【关键词】后适应；渐进延长；缺血-再灌注损伤；急性心肌梗死；丝裂原活化蛋白激酶；凋亡；细胞色素C；肿瘤坏死因子α
Gradual increased reperfusion plays better cardioprotective role through MAPK pathway ZHANG Guo-ming*，WANG Yu，LI Tian-de，LI Xiao-yan， XU Lin，SUN Yuan-yuan. *Department of Cardiology， the General Hospital of Jinan Military Command， Jinan 250031， China
Corresponding author： SUN Yuan-yuan， Email：
【Abstract】ObjectiveTo aims Study cardioprotection of different postconditioning algorithm， and investigate the role of MAPK pathway in the process.MethodsSixty SD rats were randomly（random number） divided into 5 groups， sham operation group， reperfusion/injury group（I/R group）， gradual decreased reperfusion in postconditioning （GDR， 30/10- 25/15-15/25-10/30s of reperfusion/re-occlusion） group， routine reperfusion in postconditioning （ER， 4 cycles of 20/20s of reperfusion/re-occlusion） group， and gradual increased reperfusion in postconditioning （GIR， 10/30-15/25-25/15-30/10s of reperfusion/re-occlusion） group. Acute myocardial infarction and ischemic postconditioning models were established in the rats. Six hours after reperfusion， 3 rats of each group were sacrificed and myocardial tissue were taken out to measure the level of phosphorylation of extracellular signal regulated protein kinase （P-ERK）， Phosphorylation of stress-activated protein kinase （stress activated protein kinase， P-JNK）， phosphorylation of p38 MAPK （P-p38）， tumor necrosis factor -α （TNF -α）， cysteine and aspartic protease -8 （Caspase-8） in myocardial tissue and the expression of cytochrome C in the cytosol using Western Blot method. Twenty-four hours after reperfusion all the remaining rats were to measure hemodynamic variables and level of myocardial enzyme， and myocardial tissue were taken out to determine myocardial apoptosis. A one-way analysis of variance （ANOVA） was used， and q tests were employed to determine differences in individual variables existed between groups.ResultsAll three postconditioning modalities were found to provide cardioprotection （P
【Key words】Postconditioning； Gradual increase；Ischemic reperfusion injury； Acute myocardial infarction； Mitogen activated protein kinase （MAPK）； Apoptosis； Cytochrome C； Tumor necrosis factorα
研究人员尝试使用多种方法减轻再灌注损伤[1-2]，Zhao等[3]提出缺血后适应的概念后，后适应是一种减轻再灌注损伤的有效治疗策略[4-8]。但缺血后适应的实施必须遵循严格的处理程序，否则就失去保护作用，Vinten-Johansen 等[9]称之为后适应方案。后适应效果和以下几个因素相关：一是缺血结束至后适应开始的时间[10]，二是后适应处理过程中每次短暂灌注/缺血的时间[11-12]，再者处理中灌注/缺血的循环次数也会产生影响[13]。人们很少注意到后适应处理中短暂灌注和短暂缺血的关系，大部分研究均默认两者的处理时间相等。前期研究中发现后适应的渐进模式较标准模式可以发挥更大的心肌保护作用，线粒体途径在其中发挥了重要作用[14]。既往研究认为MAPK途径是后适应的重要机制，本研究通过活体大鼠急性心肌梗死的处理，探讨mapk途径是否在渐进模式中发挥更大的作用。
1材料与方法
1.1动物模型及分组
1.1.1 模型制作健康SPF级SD大鼠60只，雌雄不拘，购于军事医学科学院实验动物中心，许可证号 SCXK 2（军） 2007-004，体质量200～250 g。按赵秀梅等[15]的球囊垫扎法复制大鼠在体心肌梗死后再灌注模型。大鼠称质量，以2%戊巴比妥钠（0.23 ml/100g）行腹腔注射麻醉，连接肢体标准Ⅱ导联心电图，仰卧固定，颈部正中切口，插入气管插管以 HX-200 型动物呼吸机辅助呼吸（潮气量 30 ml/ kg，频率50～60 次/min，吸呼比1∶2） 。开胸后暴露心脏，剪开心包，在左心耳下缘与肺动脉圆锥间用5-0带针缝合线穿过前降支深部，将充盈的后扩张球囊（Grip，3.0×12 mm，Acrostak 公司，瑞士，压力调为1 atm（1 atm=101.325 kPa）垫于血管与结扎线之间，用力结扎，而后将压力泵压力调节为12 atm。缺血45 min后将压力泵压力迅速调为0 atm，根据分组给予不同处理，后适应处理中再闭塞时将压力泵压力迅速调为12 atm。而后以3-0丝线缝合胸腔和胸部皮肤，待大鼠苏醒后拔出气管插管，缝合气管和颈部皮肤，给予正常饮食。术后6 h（每组3只）或24 h（每组7只），以20%乌拉坦（0.8 ml/100g）腹腔注射麻醉，经右颈总动脉插入左心室导管，使用生物信号及压力测试系统（MFL lab 200）监测主动脉及左心室血流动力学参数。而后通过颈动脉插管抽取血3～4 ml，而后根据所测指标不同给予不同处理：（1）凋亡检测：使用术后24 h者，取出心脏置于中性甲醛固定24 h（10%，pH=7.4）；（2）Western Blot检测：使用术后6 h处死者，取出心脏后切掉心房和右心室，液氮冷冻后置于-80 ℃冰箱保存备用。
1.1.2主要试剂凋亡试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，P-ERK、P-JNK、P-p38、TNF-α、Caspase-8和Cyt-c多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，相应二抗购自瑞典Amersham公司。其余化学试剂为国产分析纯产品。
1.1.3实验分组随机（随机数字法）将大鼠分为5组（每组12只），如图1所示。（1）假手术组（Sham）：开胸，分离左冠状动脉并穿线，但不结扎，旷置45 min；（2）缺血-再灌注组（I/R）：缺血45 min后将压力泵压力调至0 atm，恢复持续再灌注；（3）渐进缩短后适应组（GDR）：缺血45 min后、再灌注前通过球囊放气-充盈实现再灌注和缺血反复4轮，其时间为30/10—25/15—15/25—10/30 s，而后持续再灌注；（4）标准后适应组（ER）：缺血45 min后、再灌注前通过球囊放气-充盈实现再灌注和缺血反复4轮，其时间为20/20 s×4，而后持续再灌注；（5）渐进延长后适应组（GIR）：缺血45 min后、再灌注前通过球囊放气-充盈实现再灌注和缺血反复4轮，其时间为10/30-15/25-25/15-30/10 s，而后持续再灌注。
黑色代表缺血，白色代表灌注，GDR组后处理方案为30/10—25/15—15/25—10/30 s，ER组为20/20 s×4，GIR组为10/30—15/25—25/15—30/10 s
图1实验各组处理模式
Fig 1Experimental protocols in all groups
1.1.4检测指标心肌酶测定 经动脉插管抽取动脉血，3000 r/min离心15 min后分离留上清，液氮冷冻后-80 ℃冰箱保存，而后送总医院生化科以全自动生化分析仪（日本日立公司）测定肌酸激酶（creatine kinase，CK）和肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB ， CK-MB）活性。
凋亡检测：再灌注24 h麻醉经颈动脉取血后，取出心脏将缺血区心肌组织（左室前壁中间段）剪下，中性甲醛固定24 h， 常规石蜡包埋，用末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记（ terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP-biotinnick end labeling ， TUNEL）法按试剂盒说明进行心肌组织切片细胞凋亡的原位检测。共聚焦显微镜波长520 nm下观察切片，正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡细胞核呈绿色。每张切片于凋亡细胞分布区域各取5个高倍视野，计算出平均每100个细胞中的凋亡细胞数，并以百分数（%）表示凋亡指数（apoptotic index，AI）。
Western blot 分析：再灌注6 h后取出心脏-80 ℃冷冻，而后提取心肌组织总蛋白，取上述蛋白提取液上清（含蛋白200 μg）进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） ，将电泳分离后的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，经封闭、洗脱后分别加入磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶（P-ERK）、磷酸化应激活化蛋白激酶（stress activated protein kinase，P-JNK）、磷酸化p38 MAPK（P-p38）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8（caspase-8）多克隆抗体（均为1∶200），室温孵育6 h ，洗膜后以相应的二抗室温孵育1 h，并以兔抗小鼠β-actin（1∶200）单克隆抗体同样操作作为对照。抗原抗体复合物用ECL法显示，暗室X光胶片曝光，采用Image-Pro Plus 图像分析软件（Version 4.1，Media Cybernetics ， L P ， USA）分析蛋白条带的积分光密度值（ integrated optical density， IOD） ， IOD = 平均光密度值×面积，以靶蛋白IOD值/β-actin IOD值的比值反映靶蛋白相对水平。细胞色素C（cytochrome C，Cyt-c）的测定，按Li等[16]报道的方法进行，首先使用心肌组织差速离心法去除组织线粒体，上清液即为胞浆，胞浆进行蛋白定量后按上述组织Western Blot方法进行电泳、转膜、免疫反应、显色和分析。
1.2统计学方法
计量资料采用均数±标准差（x±s）表示， 应用 SPSS 13. 0 统计软件对实验数据进行分析，多组间比较应用单因素方差分析，组间两两比较应用q检验。以P
2结果
2.1血流动力学
各组24 h后的血流动力学资料详见表1。其中心率和平均动脉压差异无统计学意义，但心率血压积（RPP）各组差异具有统计学意义，I/R组小于GDR， ER 和GIR组（P
表1再灌注24 h 血流动力学比较（x±s，n=9）
Table 1Hemodynamic data obtained 24 h after reperfusion（x±s，n=12）
如图2所示，CK和CK-MB在各组间差异具有统计学意义，其中I/R组明显高于其他各组（P
与I/R组比较，aP
图2心肌损伤标记物
Fig 2Comparison of myocardial injury marker2.3心肌细胞凋亡
图3显示了24 h后心肌细胞凋亡指数的比较，所有胞核染成蓝色，而凋亡细胞核被染成绿色。Sham组很少见到TUNEL染色阳性的凋亡细胞，I/R组凋亡细胞明显多于其他后处理各组（P
与I/R组比较，aP
图3凋亡指数比较
Fig 3Comparison of apoptotic index2.4Western blot检测磷酸化MAPK（P-ERK、P-p38、P-JNK）的表达
图4显示了磷酸化MAPK，即P- ERK、P-p38、P-JNK在各组中的表达，后适应处理各组中P- ERK表达明显高于I/R组 （P
与I/R组比较，aP
图4Western blot检测P-ERK、P-JNK和P-p38 MAPK表达
Fig 4Comparison of the expression of P-ERK、P-JNK and
P-p38 MAPK by Western blot2.5Western blot检测TNF-α和Caspase-8的表达
图5 显示了TNF-α和Caspase-8在各组中的表达，后适应处理各组中TNF-α和Caspase-8表达明显低于I/R组 （P
2.6Western blot检测胞浆中Cyt-c的表达
图6显示了各组胞浆中Cyt-c的表达，3种后适应处理组较I/R组均可显著降低Cyt-c胞浆中的浓度（P
3讨论
后适应是近年来发现的可减轻再灌注损伤的全新理念，其特点在于必须遵循一定的处理方案，在既往的后适应处理方案研究中，人们很少注意到后适应处理过程中短暂灌注和短暂缺血的相互关系[10-13]。Penna等[17]在活体大鼠中比较了“修改后适应”和“经典后适应”的不同，前者处理方案是15/20—20/15—25/10—30/5 s的渐进方案，后者是5个10/10 s的简单重复方案；发现2种方案心肌梗死面积和乳酸脱氢酶水平无明显差异。但以上研究未进行凋亡以及其他指标的详细测定；再者2种方案的全部处理时间并不相同，修改方案是140 s而经典方案是100 s。因此假设如果将后适应处理过程中的短暂灌注时间逐渐延长（而每个灌注/缺血循环的时间不变，即同时短暂缺血时间逐渐缩短），则其与渐进灌注更趋相似，可能较标准后适应方案会起到更好的保护效果。
与I/R组相比较，aP
图5Western Blot检测TNF-α和Caspase-8表达
Fig 5Comparison of the expression of TNF-αand Caspase-8 by Western Blot
与I/R组比较，aP
图6Western blot检测胞浆中Cyt-c表达
Fig 6Comparison of the expression of Cyt-c in the cytosol by Western blot 本研究显示3种后适应处理方案均能发挥心脏保护作用，而其中渐进延长后适应（GIR）保护作用最为明显，其次是标准后适应（ER），渐进缩短后适应（GDR）保护作用最弱。渐进延长后适应较标准后适应可显著降低凋亡指数和心肌酶、改善血流动力学，同时伴随升高的P-ERK和降低的P-p38、P-JNK、Cyt-c（胞浆中）、TNF-α和Caspase-8表达，可以看出从渐进缩短后适应—标准后适应—渐进延长后适应的过渡性变化；上述指标渐进延长后适应均显著优于渐进缩短后适应，这也从侧面证明渐进延长后适应能发挥更好的心肌保护作用。
本研究显示后适应渐进延长后适应之所以能较标准后适应发挥更好的心肌保护作用，是因为其更好的抑制了心肌细胞的坏死和凋亡。既往研究证实后适应可通过激活ERK1/2途径发挥保护作用[10]，本课题组和既往前期研究发现后适应可以抑制p38/JNK MAPK的激活，从而通过对p38/JNK MAPK—TNF-α—Caspase-8途径的抑制，减轻心肌细胞的凋亡[18-20]，本研究发现渐进延长后适应较标准后适应能更大程度激活ERK1/2，更大程度抑制p38/JNK MAPK，继而进一步影响细胞凋亡途径的激活。
细胞凋亡主要有线粒体和细胞受体两条途径传导，细胞受体途径是一重要的细胞凋亡途径，Sun等[18]认为p38/JNK MAPK活化后可上调TNF-α的合成，而TNF-α反过来又促进JNK MAPK的进一步活化，此恶性循环使其效应进一步放大[21]。本研究发现渐进延长后适应较标准后适应更大程度抑制了P-p38/JNK MAPK—TNF-α—Caspase-8途径的激活，从而减轻了细胞凋亡。另目前很多研究认为mPTP的开放既可导致凋亡又可导致坏死，关键在于mPTP开放程度，即线粒体损伤程度[22]。如果为轻度损伤，则只启动凋亡；若大量线粒体损伤，则因为能量合成受限，不能满足凋亡的能量需求，则导致细胞的坏死。前期研究发现，渐进延长再灌注模式较标准模式可更大程度抑制线粒体凋亡途径，本研究发现渐进延长再灌注模式能更大程度降低心肌酶和梗死面积，支持上述2种途径影响凋亡并进一步影响坏死发生的推论。
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（收稿日期：2013-03-07）