白癜风人群雌激素受体基因多态性与临床资料相关性分析

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作者：卢宁，高天文，姚庆君，赵明，李凯，杨励，高超 【关键词】 雌激素受体

Association between estrogen receptor gene polymorphism in vitiligo patients and their clinical data

【Abstract】 AIM: To study the association between estrogen receptorα（ERα）gene polymorphism in vitiligo patients and their clinical data． METHODS: Polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCRRFLP) was used to study the ERα intron 1 Pvu II C/T (rs2234693) polymorphisms in 466 patients with vitiligo. Genotypes were determined and allele frequencies were compared to find their relationship with their clinical data. RESULTS:　 The genotype and allele frequency distributions were not significantly different among vitiligo patients with different subtypes, sex, onset age, with/without other autoimmune diseases and family history (P>0.05), while P values were in the range of 0.081-0.364 between segmental and two generalized type vitiligo patients (segmental vs universal, P=0.100; segmental vs common, P=0.081). And P values were near 0.05 when the C/T genotype frequency was compared between onset age of lower than 12 years old and of 12-20 years old (P=0.085); P values were also low in comparisons of genotype (P=0.195) and allele frequencies (P=0.165) between the male and the female patients. CONCLUSION: When the genotype and allele frequencies of the ERα intron 1 C/T polymorphism were compared among vitiligo patients with different subtypes, sex, onset age, with/without other autoimmune diseases and family history, no significant difference was observed. However, a tendency of significant differences was observed in comparisons of female and male vitiligo patients, segmental and generalized types, and different onset age (<12 years old vs 12-20 years old). ERα gene may be a possible risk factor especially for the female, generalized type or children vitiligo patients.

【Keywords】 estrogen receptoralpha; polymorphism, genetic; vitiligo; clinical data

【摘要】 目的： 探讨白癜风人群雌激素受体α（estrogen receptorα, ERα）基因多态性与其临床资料之间的关系. 方法： 应用多聚酶链反应?限制性片段长度多态性（PCRRFLP）分析技术，应用两对引物双重检测466例汉族白癜风患者ERα基因内含子1 Pvu II酶切位点C/T (rs2234693) 突变处基因多态性，并比较了该人群雌激素受体基因多态性分布与其临床资料之间的关系. 结果： 白癜风人群基因内含子1 C/T基因型频率及等位基因频率在不同临床类型、性别、发病年龄、病期（稳定与活动）、伴/不伴自身免疫疾病及有无家族成史之间均无统计学差别(P>0.05)，但在皮节型与寻常型之间相比的P值在0.081-0.364范围内，（其中皮节型与泛发型相比C/T基因型频率P=0.100，皮节型与散发型相比C/T等位基因频率P=0.081），12岁以下与12~20年龄组之间基因型频率相比的P值（P=0.085）较接近0.05，男/女基因型频率相比（P=0.195）及等位基因频率相比（P=0.165）亦较低，有差别趋势. 结论： 白癜风人群ERα内含子1 Pvu II酶切位点C/T基因型频率及等位基因频率在不同临床类型、性别、发病年龄、病期（稳定与活动）、伴/不伴自身疾病及有无家族史之间均无显著差别，但在皮节型与寻常型、发病年龄12岁以下与12~20之间、男女之间有差别明显化的趋势，提示携带C基因可能是儿童期发病、寻常型及女性白癜风患者的易感因素.

【关键词】 雌激素受体α；多态现象，遗传；白癜风；临床资料

0引言

目前认为白癜风属于多基因遗传性疾病，与遗传和环境因素密切相关. 随着研究的进展，一系列的侯选基因包括雌激素受体α（estrogen receptorα, ERα）基因内含子1Pvu II酶切位点C/T多态性被认为与白癜风易感性有关［1］. 我们采用聚合酶链反应?限制性片段长度多态性（PCRRFLP）分析方法研究了汉族白癜风人群ERα基因内含子1限制性内切酶Pvu II酶切位点C/T（rs2234693）基因多态性分布与其临床资料之间的关系.

1对象和方法

1.1对象随机选择200506/200606第四军医大学西京医院皮肤科门诊就诊的汉族白癜风患者466例，均符合中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会色素病学组2003年白癜风临床分型及疗效标准［2］，经患者知情同意并由本人或监护人签名后，收集血液标本，同时采用调查表形式，记录患者的姓名、地址、电话、性别、年龄、职业、民族、发病年龄、部位、季节、可能的诱发因素、疾病类型、病期（稳定与活动）、伴发疾病及家族成员的患病情况等临床资料. 其中男231例，女235例，年龄3~61（24.3±12）岁.

1.2方法

1．2．1引物的设计与合成引物1设计参照文献［3］ ，引物2为应用primer5自行设计，均由北京奥科生物技术有限责任公司上海分公司合成，引物2 PCR产物经该公司测序证实. 引物1序列：正向引物5′GAT ATC CAG GGT TAT GTG GCA3′，反向引物5′AGG TGT TGC CTA TTA TAT TAA CCT TGA3′；引物2序列： 正向引物5′CAG TCA CAC ATC ACC ATT CTC AG3′，反向引物5′TCA TTA CCT CTT GCC GTC TGT3′.

1．2．2DNA的提取分别抽取外周静脉血(柠檬酸抗凝)2 mL，用DNA提取试剂盒（由北京天为时代科技有限公司提供）按说明方法提取基因组DNA，经紫外分光光度仪测定含量及纯度.

1．2．3ERα基因型分析扩增条件为反应体系总体积均为20 μL，其中含0.1 μg基因组DNA, 10 μL 2×Mix（西安润德生物工程有限公司提供），包含1.67 nkat Tag DNA聚合酶，500 μmol/L dNTPs, 20 mmol/L TrisHCl（pH 8.3）, 100 mmol/L KCl, 3 mmol/L MgCl2，另加入各0.5 mmol/L上下游引物，8.5 μL三蒸水后置PCR仪反应. PCR反应条件： 94℃预变性2 min，1个循环；94℃变性30 s，退火30 s（引物1为57℃，引物2为65℃），72℃延伸45 s，共35个循环；62℃延伸7 min，1个循环. 分别取扩增产物5 μL与83.35 nkat PvuⅡ酶（美国NEB公司产品）于37℃温箱内酶切过夜（16 h），于15 g/L琼脂糖琼脂糖凝胶（含溴化乙锭）中电泳分离，将凝胶置于紫外凝胶成像仪下照相判断基因型. 引物1扩增产物片段为345 bp，引物2扩增产物片段为618 bp. PvuⅡ酶切检出3种基因型：缺乏PvuⅡ酶切位点为CC型(346或618 bp一条带)，杂合子为CT型(346，242和103 bp或618，346和272 bp三条带)，存在Pvu II酶切位点为TT型（242和103 bp两条带或346和272 bp两条带）. 两者结果一致者为有效结果（图1，2）.

图1－图2　略

统计学处理： 按临床资料分别计算白癜风人群酶切后ERα基因各基因型的频率和等位基因频率，使用SPSS12.0统计分析软件进行数据分析，各组间差异采用多样本R×C表χ2检验，并以P<0.05为具有统计学意义.

2结果

白癜风人群基因内含子1 Pvu II酶切位点C/T基因型频率及等位基因频率在5种不同临床类型、性别、发病年龄、病期（稳定与活动），伴/不伴自身免疫疾病及有无家族史之间均无统计学差别（P>0.05），但在皮节型与寻常型（非皮节型，分为局限型、肢端颜面型、散发型、泛发型4型）之间相比的P值在0.081~0.364范围内（其中皮节型与泛发型相比C/T基因型频率P=0.100，皮节型与散发型相比C/T等位基因频率P=0.081），12岁以下与12~20年龄组之间基因型频率相比的P值（P=0.085）较接近0.05，女/男之间基因型频率相比（P=0.195）及等位基因频率相比（P=0.165）的P值亦较低，有差别趋势（表1，2）.

3讨论

基因多态性是人类基因组中一个较为常见的现象，但发生在某些基因位点上的多态性对基因的转录表达或基因产物的功能将产生影响. 由基因背景及

表1白癜风患者不同临床分型ERα基因内含子1C/T基因型频率及等位基因频率分布［略］

表2白癜风患者ERα基因内含子1C/T基因型频率、等位基因频率分布与其临床资料［略］

环境因素导致的体内雌激素等性激素作用失调一直被认为对许多疾病发生发展具有重要意义. 已有报道ERα基因PvuⅡ酶切位点C/T多态性与乳腺癌、骨质疏松、类风湿关节炎、多发性硬化、糖尿病等［4-5］有关. 韩国Jin等［1］通过对120位白癜风患者和254位健康对照者的研究发现，两组ERα基因内含子1C/T等位基因频率有显著差别(P=0.034)，由于其样本数较小（120例）及人种的差别，有必要扩大样本进行汉族人白癜风的相关研究. 本文分析了雌激素受体ERα基因内含子1 C/T多态性与白癜风人群临床资料的关系. 本数据表明ERα基因内含子1C/T基因型及等位基因频率与白癜风人群相关临床资料包括： 不同临床类型、性别、发病年龄、病期（稳定与活动），伴/不伴自身疾病及有无家族史之间均无显著差别，但在皮节型与寻常型、不同发病年龄、男女之间有差别明显化的趋势，提示携带C基因可能是儿童期发病、寻常型及女性白癜风患者的易感因素，在白癜风发生、发展过程中可能具有促进作用. 其机制可能是由于ERα 基因1号内含子位于氨基酸末端主要转录功能区，含有增强子、启动子等重要序列，因此在其中发生点突变可能会影响到ERα的表达和功能［3］，同时雌激素又能通过与雌激素受体ER结合而调控许多免疫相关基因［6］. 另外，人类黑素细胞表面表达ER，雌激素能够增加色素细胞活性，使皮肤色素增加［7］. 反之，有报道先天性卵巢发育不全综合征（Turners syndrome）晕痣患病率达18.05%［8］. 目前雌激素及其受体在人类黑素形成过程中发挥的作用及其机制尚不完全清楚，雌激素受体基因多态性与白癜风的可能相关性及作用机制亦有待更深入研究.

【参考文献】

［1］ Jina SY, Parkb HH, Lia GZ. Association of estrogen receptor 1 intron 1 C/T polymorphism in Korean vitiligo patients ［J］. J Dermatol Sci, 2004,35(3):181-186.

［2］ 中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会色素病学组白癜风的临床分型及疗效标准［J］. 中华皮肤科杂志，2004,37（7）:440.

［3］ Ushiyama T, Ueyama H, Inoue K, et a1. Estrogen receptor gene polymorphism and generalized osteoarthritis［J］. J Rheumatol, 1998,25:134-137.

［4］ Kikuchi S, Fukazawa T, Niino M, et a1. Estrogen receptor gene polymorphism and multiple sclerosis in Japanese patients: interaction with HLADRB1 1501 end disease modulation［J］. J Neuroimmunol, 2002,128 (12)：77-81.

［5］ Ushiyama T，Ueyama H，Inoue K，et a1．Estrogen receptor gene polymorphism and generalized osteoarthritis［J］．J Rheumatol, 1998,25:134-137.

［6］ Zang YC，Halder JB，Hong J，et a1. Regulatory effects of estriol on T cell migration and cytokine profile：inhibition of transcription factor NFkappa B ［J］．J Neuroimmunol, 2002,124(12):106-114.

［7］ Shahrad P and Marks R. A pharmacological effect of oestrogene on human epidermis［J］．Br J Dermatol, 1977,97:383-386.

［8］ Brazzelli V, Larizza D, Martinetti M. Halo nevus, rather than vitiligo, is a typical dermatologic finding of turners syndrome: clinical, genetic, and immunogenetic study in 72 patients［J］．J Am Acad Dermatol, 2004,51(3):354-358.