浅析RANi作用机制及其在农业生产中的应用
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摘要：阐述了rna干扰(rnai)现象的发现、作用机制,分析了rani技术在农业生产中的主要应用,以为rani的进一步研究应用提供依据。
关键词：rnai;作用机制;农业生产
近年来研究表明,一些小的双链rna(dsrna)能通过促使mrna降解,高效特异的抑制细胞内与其同源序列基因的表达,诱使细胞表现特定基因缺失的表型,称为rna干扰(rna interference,rnai)。不同的有机体,包括植物、果蝇、线虫及一些哺乳动物大多能利用rna干扰来抵御病毒及其他外来核酸的侵入,提示它可能是生物体的一种进化保守机制。同时,也可能成为基因功能分析和基因治疗的一个革命性工具。
1rna干扰的发现和命名
1995年,guo和kemphues试图利用正义rna影响秀丽新小杆线虫中的par-1基因的表达,以期观察到基因表达的增强,结果意外的发现正义rna链和反义rna链同样地抑制了par-1基因的表达。这与传统上对反义rna技术的解释正好相反。这是ran干扰现象的首次发现,但是2人未能作出合理解释[1]。直到1998年,fire等证实了正义rna链抑制基因表达,以及过去的反义rna对基因表达的阻断,都是由于体外转录所得rna中污染了微量双链rna而引起。当他们将体外转录得到的单链rna纯化后注射线虫时发现,基因抑制效应变得十分微弱,而经过纯化的双链rna却正好相反,能够高效特异性阻断相应基因的表达。该小组将这一现象称为rna干扰(rna interference,rnai)[2]。
2rna干扰的机制
对于rna 干涉的机制,人们先后提出多种模型。hynes等认为rna干涉是生物在长期进化过程中形成的一种对病毒侵染的抗性,与基因表达产物的过量与否无关;当病毒或转入的外源基因内部有同源序列,或外源基因与内源基因之间有同源序列时,往往会导致异位配对(ectopic pairing),并转录产生双链的异常rna(aberrant rna,arna),细胞中一旦产生arna,就会激活rdrps 的活性,rdrps再以arna为模板合成大量21～25 bp的互补rna(complementary rna,crna)。这些crna 与同源mrna 结合形成部分双链结构dsrna,被双链特异性rnase 识别并降解。waterhouse将正义rna 和反义rna导入植物后,发现正义rna与反义rna共转录比二者单独作用更易引起基因沉默。于是他们认为异位配对并不是导致基因沉默的根本原因,而根本原因在于外源基因插入受体基因组中的方向不同,导致正义rna和反义rna的合成。这些转录产物形成dsrna,dsrna 在细胞质中被螺旋酶、rdrps 和类似于rnasel 的核酸内切酶形成的复合体所识别。螺旋酶使双链解旋,rdrps 以其中一条链为模板合成crna,类似于rnasel 的核酸内切酶结合于crna 的两端,当crna与具有同源序列的mrna结合以后,rnasel在单链处切开mrna 分子,从而使mrna 降解,基因沉默,并由此提出了双链rna模型[3]。
在该模型中,rnai发生的基本过程可分为起始阶段和效应阶段。在起始阶段,rnaseⅲ家族的双链特异的核糖核酸酶(在果蝇中命名为dicer)以atp依赖的方式将长的dsrna切割成21~23 nt的小干扰 rna(small interfering rna,sirna)[4-5]。在效应阶段,sirna参与形成rna诱导的沉默复合物(rna-induced silencing complex,risc)[6]。risc以atp依赖的方式催化双链sirna解旋,然后利用其内部的单链sirna/mirna,通过碱基配对识别与之互补的靶 rna,随后,risc中的核酸内切酶在距离sirna 3′端12个碱基的位置切割靶rna[7]。最后,切割后的靶 rna在核酸外切酶的作用下被降解,导致目的基因的沉默。
随着rnai技术的日益成熟,其在各个领域的应用也越来越广泛,在农业生产中尤其是育种和作物抗病毒方面也发挥着巨大的作用。
3.1在育种方面的应用研究
雄性不育系及恢复系的培育是产生具有优良性状杂交种的前提,在育种上有重大意义。目前,有很多研究者通过 rnai技术控制植物花期,研究植物雄性不育及育性恢复。首先,可以培育出受控制的能稳定遗传的不育植株;其次,可减少基因污染,促进植株生长,控制花期,缩短育种周期。chuang[8]等用rnai证明了拟南芥中和花发育有关的基因,获了能稳定遗传的雄性不育突变体。其他植物
中也有和其同源的基因,可进一步研究其功能,以获得其他植物雄性不育突变体。在育种工作中,远源杂交(或自交)不亲和性使人们难以获得优良的杂交种。为了解决这一问题,人们研究提出许多途径,如选择亲和或不亲和性弱的品种进行种间杂交,增加染色体倍数以促进亲和性较多表现等方法。ht基因是mcclure等发现的在分子水平上和花粉自交不亲和性有关的基因,其在烟草花柱中的表达使花柱富含天冬氨酰蛋白。brien等为阐明ht基因的功能,构建了反义scht-a和rnai scht-b系统。在反义系统中scht-a mrna水平有很大降低,没有植物变为自交亲和。在进一步构建的rnaischt-b系统中,scht-b mrna特意的干扰,而不会影响到scht-a mrna。结果表明,只有scht-b基因和自交不亲和现象有关,并发现30%的scht-b基因对维持自交不亲和现象是必须的[9]。除了以上的应用外,rnai在植物淀粉合成途径、改变植物中淀粉含量、增加植物抗逆性等多方面的应用均有报道 。
3.2rnai技术在作物抗病毒方面的应用
rnai序列特异性识别并降解目标rna,在包括真菌、植物和动物的大量真核生物中都有发现,并被认为是植物的一种抵抗病毒的防御机制。研究者发现,转入病毒基因的植物会对此病毒具有抗性,并且rna沉默一旦建立,所有和其同源的rna都会被降解,即植物对同一种病毒的第2次侵染以及与这种病毒部分同源的其他病毒都具有抗性[10]。rnai技术有助于更加深入的了解植物抵抗病毒入侵的机制,并据此培育出具有优良品质的抗病植株。水稻黄斑病毒 rymv在非洲广泛流行,自然的预防机制为隐性、多基因性状。将该病毒复制所需的某种酶的基因转入水稻,诱发基因沉默,从而使植物具有rymv病毒的抗性,这种抗性能稳定遗传3代。进一步研究发现,很多植物rna病毒也会编码特定的蛋白抑制基因沉默的发生。玉米矮花叶病毒和玉米炭疽线条病毒存在c2/c2一基因,可抑制植物中的rnai,使c2转录水平升高,花青苷色素沉积加强。有人转入李瘟病毒(plum pox virus,ppv)nib序列的烟草在 ppv 编码沉默抑制子(hcpro)情况下,表现出因 rna沉默引发的对 ppv 的抗性。用具有转基因沉默和病毒抗性的愈伤组织进一步试验证明,能产生沉默抑制子2b和hcpi'o的黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,cmv)和烟草脉状病毒(tobacco vein mottling virus,tvmv)都具有病毒抗性。只有由cmv产生而不是由原有tvmv产生的沉默抑制子可以抑制基因沉默,使植株再次变为ppv易感型[11]。rnai的这些研究可帮助人们揭开植物抗病的机理,为最终培育出所需要的优质抗病植株奠定基础。
4参考文献
[1] guo s,kempheus k j.par-1,gene required for establishing polarity in c.elegans embryos,encodes a putative ser/thr kinase that is asymm-etrically distributed[j].cell,1995,81(4):611-620.
[2] fire a,xu s,montgomery m k,et a1.polent and specific genetic interference by double stranded rna in eaenorhabditis elegans[j].nature,1998,391:806-811.
[3] hynes t r,s m mervine,e a yost,et al.live cell imaging of gs and the 2-adrenergic receptor demonstrates that both s and 17 internalize upon stimulation and exhibit similar trafficking patterns that differ from that of the 2-adrenergic receptor[j].biol chem,2004(279):44101-44112.
[4] zamore pd,tuschl t,sharp pa,et al.rnai:double-stranded rna directs the atp-dependent[j].cell,2000,101(1):25-33.
[5] bernstein e,allis c d.rna meets chromatin[
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[6] hammond s m,bernstein e,beach d,et.al.an rna-directed nuclease mediates posttranscription algene silencing in drosophila cells[j].nature,2000,404(6775):293-296.
[7] nykanen a,haley b,zamore p d.atp requirements and small interfering rna structure in the rna interference pathway[j].cell,2001,107(3)309-321.
[8] chuang,meyerowitz e m.specific and heritable genetic inter-ference by double-stranded rna in arabidopsis thaliana.proc.natl[j].acad sci usa,2000,97(9):4985-5054.
[9] stoy s j,shibuya h,brien d o,et al.a bsl ⅰ pcr-rflp in the rennin binding protein(rnbp)[j].animal genetics,1997(29):327-328.
[10] herve vaucheret,christophe beelin.mathilde fagard.post-transcriptional gene silencing in plants[j].journal of cell science,2001(114):3088-3091.
[11] simon-mateo,garcia j a.microrna-guided processing impairs plum pox virus replication,but the virus readily evolves to escape this silencing mechanism[j].j virol,2006,80(5):429-2436.
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