RP-HPLC测定拉莫三嗪和苯巴比妥的血药浓度

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[摘要] 目的:建立rp-hplc法同时测定人血清中抗癫痫药拉莫三嗪和苯巴比妥浓度的方法。方法:采用Agilent Zorbax XDB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)色谱柱;流动相:0.1%乙酸-乙腈,梯度洗脱;检测波长:240 nm;流速:1.0 ml/min。结果:拉莫三嗪和苯巴比妥的血药浓度分别在0.02～1.00 μg、0.02～3.00 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系,平均回收率分别为97.62%和97.96%,拉莫三嗪2.0、20.0、40.0 μg/ml日内精密度(RSD,n=5)分别为4.3%、3.9%和2.9%,日间精密度(RSD,n=5)分别为5.1%、5.4%%和3.9%;苯巴比妥5.0、20.0和50.0 μg/ml日内精密度(RSD,n=5)分别为3.5%、4.2%和3.6%,日间精密度(RSD,n=5)分别为5.0%、4.7%和4.2%。结论:本方法简便、准确、重现性好,可用于临床上常规监测拉莫三嗪和苯巴比妥的血药浓度。

[关键词] 拉莫三嗪;苯巴比妥;血药浓度;梯度洗脱;反相高效液相法

[中图分类号] R927.2[文献标识码] B[文章编号] 1673-7210(2010)03(b)-039-03

Content determination of Lamotrigine and Phenobarbital in human plasma by RP-HPLC

DU Jun, LI Yijun*

(Department of Pharmacy, People's Hospital of Jingshi, Jingshi415400, China)

[Abstract] Objective: To establish a method for the content determination of lamotrigine and phenobarbital in human plasma by RP-HPLC. Methods: The Agilent Zorbax XDB-C18 (4.6 mm×150 mm, 5 μm) column was used. The mobile phases consisted of 0.1% acetic acid and acetonitrile, gradient elution. The flow rate was 1.0 ml/min and the detection wavelength was at 240 nm. Results: The linear ranges of Diphenhydramine Hydrochloride were at 0.02-1.00 μg and 0.02-3.00 μg, respectively. Lamotrigine presented a good linear relationship in the range of 1.00-50.0 μg/ml (r=0.999 1); phenobarbital in the range of 1.00-150.0 μg/ml (r=0.999 0). The intra-day RSD (n=5) of 2.0, 20.0 and 40.0 μg/ml of lamotrigine were 4.3%, 3.9% and 2.9%; the inter-day RSD (n=5) were 5.1%, 5.4% and 3.9%. The intra-day RSD of 5.0, 20.0 and 50.0 μg/ml of phenobarbital were 3.5%, 4.2% and 3.6% (n=5); the inter-day RSD were 5.0%, 4.7% and 4.2% (n=5),respectively. The recovery rates (n=5) of lamotrigine and phenobarbital were 97.62% and 97.96%, respectively.Conclusion: The method is fast, reliable, accurate and can be used in monitoring plasma levels of lamotrigine and phenobarbital in clinic.

[Key words] Lamotrigine; Phenobarbital; Serum level of drug; Gradient elution; Content determination; RP-HPLC

拉莫三嗪(1amotrigine,LTG)为一种新型的广谱抗癫痫药,对部分性发作、GTCS、Lennox-Gastaut综合征、失神发作和肌阵挛发作有效,临床上用于难治性癫痫的辅助治疗[1-3]。由于其半衰期较长(24～30 h),可以每日1次给药。苯巴比妥(phenobarbital,PBT)常作为小儿癫痫的首选药物,广谱,起效快,对GTCS疗效好,也用于单纯及复杂部分性发作,对发热惊厥有预防作用[4-5],半衰期长达37～399 h。上述药物的治疗范围窄,且抗癫痫效果、药物不良反应与药动学特征有关。为了评价疗效或确定给药方案,使给药方案个体化,以提高药物治疗水平,达到临床安全、有效、合理的用药。因此开展治疗药物监测有重要临床意义。本研究在文献[2-6]的基础上进行改进,采用以氯硝西泮(Clonazepam,CNZ)为内标,建立了HPLC法同时测定两者的浓度,为临床合理用药提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent高效液相色谱分析仪(美国Agilent公司);低温高速离心机(德国Beckman公司);KQ50B型超声波清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公司);XW-80A漩涡混和器(上海医科大学仪器厂);电子分析天平(AG285型,瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 试药

LTG对照品(批号:051130,葛兰素史克制药有限公司,纯度:99.5%);苯巴比妥对照品(批号:171222-200504,中国药品生物制品检定所);内标氯硝西泮(批号:150230-200201,中国药品生物制品检定所);乙腈、甲醇、二氯甲烷均为进口色谱纯(美国Tedia公司);磷酸钾缓冲液(PBS,北京中杉金桥生物技术有限公司,分析纯);异丙醇(国药集团化学试剂有限公司,分析纯);水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Agilent Zorbax XDB-Cl8柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱;流动相:0.1%乙酸-乙腈;梯度程序为:0.007.00 min,A∶B=90∶10;7.0012.00 min,A∶B=70∶30;12.0014.00 min,A∶B=90∶10。流速:1.0 ml/min;检测波长:240 nm;柱温:40℃;内标:氯硝西泮;结果表明,LTG、PBT和CNZ的保留时间分别约为6.2、10.8和12.7 min,各成分峰形良好,分离完全。色谱图见图1。

图 1 HPLC色谱图

(A. 空白血清;B.供试品;a.拉莫三嗪;b.氯硝西泮;c.苯巴比妥)

Fig.1 HPLC chromatography

(A.Black serum substance; B.Sample; a.Lamotrigine; b.Phenobarbital;

c.Clonazepam)

2.2 对照品溶液和内标贮备液的制备

精密称取LTG、PBT和 CNZ 10.0、10.0和5.00 mg,分别置于25 ml量瓶中,加甲醇溶液溶解并定容配制成400.0,400.0和200.0 μg/ml的贮备液。

2.3 样本采集

清晨患者服药前抽取静脉血2 ml,室温3 500 r/min离心8 min,分离并留取血清,置-20℃冰箱保存,待测。

2.4 血样预处理

冰箱中取出血清,室温解冻,吸取血清200 μl,置5 ml的离心管中,加入CNZ贮备液 10 μl、乙酸乙酯1 ml,涡旋混合60 s,3 500 r/min离心10 min,吸取乙酸乙酯,于40℃用氮气吹干,加入甲醇溶液100 μl溶解,精密吸取取20 μl进样。

2.5 线性关系考察

2.5.1 标准血样精密量取“2.2”项下贮备液适量,用甲醇溶液稀释,加入适量空白人血清,制成含LTG l.0～50.0 μg/ml、PBT 1.0～150.0 μg/ml的系列浓度标准血样。

2.5.2 线性试验取“2.5.1”项下含LTG分别为1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/ml,含PBT分别为1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、150.0 μg/ml的标准血样,按“2.4”项下方法处理,进样测定,分别以样品与内标的峰面积比Y对浓度C线性回归,得LTG标准曲线为:Y=0.173 9C-0.022 1(r=0.999 1);PBT标准曲线为Y=0.210 5C+0.033 7(r=0.999 0)。表明血清中LTG在1.00～50.00 μg/ml和PBT在1.0～150.0 μg/ml的浓度范围内线性关系良好。

2.6 回收率和精密度实验

取人空白血清200 μl,分别加入LTG和PBT对照品工作液,配成浓度为2.00、20.00和40.00 μg/ml和浓度为5.0、20.0和50.0 μg/ml的标准血清。按“2.4”项下方法操作,分别测得两药物的回收率及日内、间精密度,结果见表1。LTG及PBT的平均回收率均>97.0%,日内精密度

2.7 干扰实验

在此色谱条件下,苯妥英钠和卡马西平的保留时间分别为15.1 min和21.3 min,对两种药物峰及内标峰均无干扰。用本法监测的56例样品中,亦未见有其他峰干扰。

2.8 人体血样测定

本法用于数例患者服药达稳态后(门诊患者两药均服用1个月后),血清中药物谷浓度(清晨抽取服药前患者空腹血)的测定,患者血清色谱图见图2。

3 讨论

3.1 两种药物的结构及药理作用

LTG是一联苯三嗪衍生物,为抗癫痫新药,通过作用于钠离子通道,抑制兴奋型神经递质的释放,从而达到药理活性[7],近年来已成为血药浓度检测的目标药物。PBT是苯巴比妥(Phenobarbital,PBT)为嘧啶类衍生物,为GABAA受体激动剂,作用于巴比妥酸位点而增加Cl-的传导[8]。癫痫的治疗一般主张单药治疗,但对于难治性癫痫往往采用联合用药作用于不同靶点而发挥疗效[9]。常用的抗癫痫药物由于其治疗指数小,个体差异大往往需监测合并使用的抗癫痫药的血药浓度。文献[3]有对上述两种药物含量同时测定的报道,但对测量仪器的配制要求较高,一般医疗单位不具备条件。本研究采用梯度洗脱法对化学结构、理化性质差别较大的成分进行较理想分离并对其含量测定。

3.2 波长的选择

文献[3]报道LTG在214 nm波长处吸收最大,可提高LTG测定的灵敏度,但本法采用了240 nm的波长,目的是为了兼顾PBT的含量测定,减少基线的飘移和杂质峰的影响,完全满足临床上检测的需要。

3.3 内标的选择

文献[6]报道LTG的含量测定中采用氟西泮作为内标物,PBT的含量测定[7-9]采用艾司唑仑为内标物。本实验曾尝试用到该两种化合物作内标,但在该色谱条件下与目标峰分离效果不理想,后选用氯硝西泮,考虑到三者具有较理想的分离度,且峰位又不与其他抗癫痫药物及内源性物质重叠,故本研究选择氯硝西泮作为两药物含量同时测定的内标物。

[参考文献]

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[6]涂厉标,祝永明.HPLC法同时测定人血清中苯巴比妥、苯妥英和卡马西平的浓度[J].中国药师,2005,8(11):934-936.

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[9]Schmidt D, Lampert T. Defferential diagnosis in adults. In: comprehensive epileptology [J]. New York: Raven Press,1991:449-471.

(收稿日期:2009-12-22)