高效液相色谱法测定阿托伐他汀钙片有关物质
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摘 要：采用高效液相色谱法对阿托伐他汀钙片有关物质进行检测，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（250mm×4.6mm，5μm），流动相为0.05mol/L柠檬酸溶液（用氨水调节pH值至4.0）-乙腈-四氢呋喃（53：27：20），检测波长为244nm，柱温为35℃，流速为1.5mL/min。结果表明，在所建立的色谱条件下，阿托伐他汀钙与各杂质分离良好，所建立的方法专属性、精密度、准确度、耐用性均较好，可用于阿托伐他汀钙片有关物质的测定。
心血管疾病是危害人类健康（特别是中老年）最常见、最严重的疾病之一，血脂异常是动脉粥样硬化、冠心病以及其他心脑血管疾病的重要危险因素。阿托伐他汀通过抑制肝脏内HMG-CoA还原酶和胆固醇的合成从而降低血浆中胆固醇和脂蛋白水平，并通过增加细胞表面的肝脏LDL受体以增强LDL的摄取和代谢。医学界公认比天然微生物发酵、半合成的他汀类药物好，患者使用时，起始剂量即有优异的调脂达标率。文章建立了以0.05mol/L柠檬酸溶液（用氨水调节pH值至4.0）-乙腈-四氢呋喃（53：27：20）为流动相的HPLC分析方法，用于对阿托伐他汀钙的测定[1-2]。该方法专属性良好，而且方法方便、快速、准确。
1 材料
1.1 仪器
高效液相色谱仪（Hitachi Chromaster-5430检测器，Hitachi Chromaster-5310柱温箱，Hitachi Chromaster-5210自动进样器，Hitachi Chromaster-5110泵），Chromaster色谱工作站，日本Hitachi公司；十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（250mm×4.0mm，5μm），美国Thermo公司； AR1140电子天平，美国Ohaus公司。
1.2 试剂
阿托伐他汀钙对照品（中国药品生物制品鉴定所）；阿托伐他汀钙杂质A、C、F、H对照品（USP标准物质）；乙腈、四氢呋喃为色谱纯试剂； 其余试剂为市售分析纯试剂；水为纯净水。
2 方法
2.1 色谱条件与系统适应性
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：0.05mol/L柠檬酸溶液（用氨水调节pH值至4.0）-乙腈-四氢呋喃（53：27：20）；流速：1.5ml/min；检测波长：244nm；柱温：35℃；进样量：20μl。理论塔板数按阿托伐他汀峰和阿托伐他汀钙杂质C峰计应不低于5000和7000，两峰的拖尾因子分别不得过1.5，两峰之间的分离度应不小于1.5。溶液重复进样5次，阿托伐他汀峰和阿托伐他汀钙杂质C峰的峰面积相对标准偏差应分别不得过1.0%和2.0%。
2.2 溶液配制
阿托伐他汀钙对照品溶液：取阿托伐他汀钙对照品10mg，精密称定，置100ml量瓶中，加混合溶剂[（0.05mol/L柠檬酸铵溶液（用氨水调节pH值至7.4）-乙腈（50：50）]适量，充分振摇使溶解后，用混合溶剂稀释至刻度，摇匀即得。阿托伐他汀钙供试品溶液：取阿托伐他汀钙片20片，研细，精密称取粉末适量（约相当于阿托伐他汀10mg），置100ml量瓶中，加混合溶剂适量，充分振摇使溶解后，用混合溶剂稀释至刻度，摇匀即得。
3 结果
3.1 专属性试验
取阿托伐他汀对照品与杂质对照品适量，精密称定，配成含阿托伐他汀100μg/ml与各个杂质10μg/ml的混合溶液， 进样， 阿托伐他汀与各杂质间分离良好。取阿托伐他汀对照品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，对阿托伐他汀分别进行酸、碱、氧化、热及光照破坏试验， 分别加入1mol/L盐酸适量，1mol/L氢氧化钠适量，30%双氧水适量，冷却到室温，调节pH至中性，直火烧至熔融，在4500lx光照条件暴露24h后，用稀释液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液20μl进样，记录色谱图。阿托伐他汀在不同条件下均有不同程度的降解，主成分峰与降解杂质峰分离良好。
3.2 线性相关性试验
精密称取阿托伐他汀钙杂质F、A、C、H对照品适量，加混合溶剂稀释，配制成浓度约为1.0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml的标准溶液，精密吸取各标准溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果表明阿托伐他汀钙杂质F、A、C、H分别在浓度范围1.05-4.20μg/ml、1.04-4.16μg/ml、1.13-4.52μg/ml、1.11-4.44μg/ml内呈现良好的线性相关性。
3.3 仪器精密度试验
精密称取阿托伐他汀钙杂质F、A、C、H对照品，加入混合溶剂稀释，使浓度分别约为1.5μg/ml、1.5μg/ml、1.5μg/ml、0.5μg/ml，分别配6个样，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。RSD分别为1.12%、0.83%、0.99%、1.32%。结果表明仪器精密度良好。
3.4 定量限和检测限试验
精密称取阿托伐他汀钙各杂质F、杂质A、杂质C、杂质H对照品适量，用混合溶剂逐步稀释，精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。当信噪比为10：1时，即为定量限；当信噪比为3：1时，即为检测限。杂质F、杂质A、杂质C、杂质H的定量限分别为0.40μg/ml、0.40μg/ml、0.40μg/ml、0.40μg/ml，杂质F、杂质A、杂质C、杂质H的检测限分别为0.15μg/ml、0.15μg/ml、0.15μg/ml、0.15μg/ml。
3.5 回收率试验
配制阿托伐他汀钙片溶液（阿托伐他汀约浓度为500μg/ml），精密稀释阿托伐他汀钙杂质F、A、C、H对照品贮备液做为阿托伐他汀钙杂质溶液，分别取阿托伐他汀钙片样品溶液、杂质溶液各一份混匀，配制成低、中、高三个浓度，滤过，作为样品溶液Ⅱ；另取阿托伐他汀钙片溶液适量，加混合溶剂稀释成每1ml中约含100μg的溶液，滤过，取续滤液，作为样品溶液Ⅰ，精密称取阿托伐他汀钙杂质F、A、C、H对照品适量，加入混合溶剂稀释，使浓度约为1.5μg/ml、1.5μg/ml、1.5μg/ml、0.5μg/ml作为对照品溶液；分别取上述各溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算含量，测定回收率。计算杂质F、A、C、H的回收率，平均回收率分别为100.2%、99.7%、101.3%、100.5%，RSD分别为0.87%、0.93%、1.56%、1.33%。
3.6 溶液稳定性试验
精密称取阿托伐他汀钙杂质F、A、C、H对照品适量，加入混合溶剂稀释，使浓度分别约为1.5μg/ml、1.5μg/ml、1.5μg/ml、0.5μg/ml的对照溶液，于室温、阳光不直射的情况下放置，分别于2、4、8、10、12、18、24小时取样，精密吸取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算变化率均在5.0%以内。结果表明样品溶液在室温条件下放置24h稳定。
3.7 耐用性试验
采用不同品牌色谱柱，调节流动相pH，调节水相和有机相比例，调节柱温，调节流速，进行样品有关物质测定。结果表明，符合系统适用性要求，色谱柱、流动相pH、流动相比例、柱温、流速的微小调整，对测定结果影响较小，方法耐用性良好。
参考文献
[1]S. V. Londhe， R. S. Deshmukh， S. V. Mulgund， K. S. Jain. Development and validation of a reversed-phase HPLC method for simultaneous determination of aspirin， atorvastatin calcium and clopidogrel bisulphate in capsules. Indian J Pharm Sci. 2011，73（1）： 23-29.
[2]Bahia A. Moussa， Asmaa A. El-Zaher， Marianne A. Mahrouse， and Maha S. Ahmed. Simultaneous determination of amlodipine besylate and atorvastatin calcium in binary mixture by spectrofluorimetry and HPLC coupled with fluorescence detection. Anal Chem Insights. 2013， 8： 107-115.