桉树组织培养中常见问题及解析
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【摘 要】对桉树在组培生产过程中出现褐化、玻璃化、污染等问题进行分析与提出解决方法。
【关键词】桉树组培苗褐化玻璃化污染解决方法
桉树是世界上主要产材的三大树种之一，其人工林占世界人工林的五分之一，是我国南方主要树种；桉属树种较多，有性杂交容易，但难保持优树特性，无性繁殖遗传性状稳定，目前桉树繁殖技术虽然日趋成熟，但在组培过程中常会出现许多问题，迫切需要解决，现就桉树组培苗在生产过程中出现的褐化、玻璃化、污染等问题发生原因归纳如下，并提出解决方法：
一、外植体以及增殖材料的褐化问题。
1.发生原因。
1.1选用DH3229、广林九、雷林九、广州1号、杂交桉u6等品种取幼嫩茎段进行试验对比，品种之间差异很大，外植体材料中单宁类和多酚类化合物含量高的品种易引起褐化。如DH3229、广林九、雷林九等褐化率高，而广州1号、杂交桉u6褐化率低。
1.2外植体的采集部位及切割面积与褐化相关。
通常是幼嫩部位产生褐化较轻，组织越老熟而褐化越重，切割面越大，褐化越重。
1.3外植体的取样时间及季节与褐化相关。
1.4在初级培养阶段，选择培养基成分中无机盐成分，蔗糖浓渡、激素浓度、PH值对防止褐化有影响作用。
1.5外植体的消毒剂种类、浓度及消毒时间和清洗程度对影响褐化起关键作用。
1.6初代培养的方式：温度调控、光照强度等因素不当容易引起褐化。
2.解决方法
2.1对较易产生褐化的品种，在接种的培养基里适量加入抗氧化剂和抑制剂，如抗坏血酸、柠檬酸、半胱氨酸、活性碳等。
2.2根据前人研究结果和笔者的多次试验，桉树外植体的采集材料是控制褐化的关键，在采集枝条之前先对母株或枝条进行喷施杀虫剂和杀菌剂，五天后用黑塑料袋套住需采枝条遮光处理5天左右，经预处理有助于减轻褐化，外植体材料以幼嫩的带芽茎段，长度1.5cm单芽最适宜，这样大大减少褐化率。
2.3外植体的采集时间及季节对减少褐化非常重要，大部分易褐化种源随着生长季节褐化率逐渐上升，在5、6、7、8月份达到高峰，然后又从9月份开始逐渐下降，从11月份至次年2月份取材褐化率最低。
2.4桉树在初代培养阶段大量元素和外源激素浓度增大会造成褐化加重，蔗糖浓度2%―3%。PH值为5.6―5.8，B5培养基铁盐较低较为适应桉树初代组培。
2.5选用适当消毒剂、消毒浓度和消毒时间。常用消毒剂有0.1%升汞、0.3%次氯酸钠和70%酒精。消毒时间：0.1%升汞7―9分钟，0.3%次氯酸钠15分钟，70%酒精低于10秒，每次消毒需多次用无菌水冲洗。消毒时间越长灭菌越彻底，但褐化也越严重，消毒时间过短，杀菌不彻底，因此要正确选择消毒浓度和消毒时间，才能保证较高的外植体存活。
2.6对褐化严重的品种，外植体接种后经过全暗培养10―15天后逐渐增加到1500―2000Lx光照培养，温度从低温到高温，温度16―24℃为宜，不能长期低温培养。
二、组培苗玻璃化问题
在桉树组培时经常会发现组培苗叶、嫩梢呈水晶透明或水浸状，整株矮小或高出，失绿、脆弱易碎，叶表缺少角质层蜡质，没有功能气孔，仅有海绵组织是一种生理失调或病变，在组织培养中危害相当严重，也是亟待解决的问题。
1.发生原因
1.1琼脂硬度和蔗糖浓度与玻璃化成负相关。
1.2 6BA浓度和培养室温度与玻璃化成正相关。
1.3玻璃化是培养瓶内气体与外界交换不畅有关，密闭的封瓶口材料是导致玻璃化的原因之一。
1.4培养基中高的含N量，特别是高的氨态N，也是导致玻璃化的因素之一。
2.解决方法：
2.1利用固体培养基，增加琼脂或卡拉胶浓度,降低培养基的衬质势，促使细胞吸水阻遏，适当提高蔗糖含量或加入渗透剂，降低培养基中的渗透势，降低培养容器内部环境的相对湿度。
2.2适当调低6―BA和GA3的浓底，适量加入IAA和活性碳。
2.3控制温度低温处理，温度不超过32℃,在昼夜变温交替的情况下比恒温效果好，温度过高、生长过快，玻璃苗增多。
2.4增加自然光照，光强控制在1500―3000LX，每天光照12―14小时，试验发现玻璃苗放置于自然光下几天后，茎、叶变红，玻璃化逐渐消失，自然光中紫外线能促进组培苗成熟，加快木质化。
2.5增加Ca 、 Mg 、 M n 、 K 、P 、 Fe元素含量，降低N和CL元素比例，特别降低氨态氮浓度，适当提高硝态氮含量。
2.6改善培养器的通风换气条件，如用棉塞或塑料胶盖子。
2.7用40℃热击处理愈伤组织培养物会降低内源细胞分裂素水平，可消除再生苗的玻璃化。
三、污染问题
桉树组培苗工厂化生产在我国南方发展较快，快繁技术日趋成熟，但组培苗污染率较高，造成经济损失较大，因此如何克服污染问题是不可忽视的技术环节。
1.主要原因
污染一般分为真菌污染和细菌污染，其来源可分为三大类；材料带菌污染、操作不当污染、培养过程感染；细菌污染分外生细菌污染和内生细菌污染，外生细菌污染多数是培养基消毒不合格、接种工具、接种人员操作不当而引起，而内生细菌污染多数是接种材料本身带菌。真菌污染主要来自环境条件。
2.解决方法
2.1改善环境条件，接种室与培养室、缓冲间要定期用高锰酸钾和甲醛薰蒸消毒，每次接种前接种室及工作台要开紫外灯30分钟以上，工作台启动吹风15分钟后才使用，定期（一个月）开紫外灯消毒培养室1-小时，培养室相对湿度控制在70%左右。
2.2定期培训接种人员，严格遵守操作规程，对接种所需工具要严格灭菌后才能使用，工作台内不要堆放过多待用材料，专人负责检验材料是否带菌，淘汰被污染的材料。
2.3经常检查消毒锅的灭菌质量，消毒出锅的培养基用白纱布盖实，让其缓慢冷却，避免外界冷空气倒吸入已灭菌的培养瓶内引起真菌污染。
2.4采用反复茎尖培养的方法脱除桉树组培材料的内生细菌。
2.5对外植体的消毒要正确选用表面消毒剂、消毒浓度和消毒时间。桉树外植体带芽茎段带菌少且易灭菌，繁殖快，大量试验表明：0.1%升汞灭菌7-9分钟是最理想的消毒浓度和消毒时间。根据不同的接种材料，选择消毒剂、消毒浓度和消毒时间也有所不同，需经多次实践摸索，才能找出最佳操作方案。
2.6在培养基中适量加入过滤灭菌后的抗生素如：青霉素GK、链霉素、庆大霉素等有效抑制内生菌的生长。
参考文献：
[1]欧阳磊，桉树组培快繁存在的问题与对策（J）福建林业科技2006、203-206.
[2]曹孜义、刘国民，实用植物组织培养技术教程（M）兰州，甘肃科学技术出版社1996.1-8.
[3]张远华等尾赤桉组培繁殖技术研究（J）广西科技第2008第1期.