高迁移率族蛋白1在胃癌中的表达及其与相关临床病理特征的关系
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[摘要] 目的 研究高w移率族蛋白1（HMGB1）在胃癌组织的表达，以及其与相关胃癌临床病理特征的关系。方法 选取内蒙古医科大学第一附属医院2012年3月～2013年9月术后病理明确诊断的104例胃癌及其癌旁组织标本，应用免疫组织化学法检测标本HMGB1蛋白的表达，分析HMGB1在胃癌组织和癌旁组织的差异及其与胃癌临床病理特征关系。检测HMGB1 mRNA在胃癌细胞系SGC-7901、N87、MKN45及正常胃黏膜细胞系GES-1中的表达。 结果 免疫组化显示：HMGB1阳性颗粒不仅位于细胞核上，还位于细胞质中；胃癌组织中的表达水平高于胃癌的癌旁组织（P < 0.01）。QPCR均显示：HMGB1 mRNA在正常胃黏膜细胞中的表达水平低于低分化胃癌细胞（P < 0.01）。 结论 HMGB1在胃癌组织中表达较高，特别是低分化胃癌，推测可能参与胃癌发生和发展，但在胃癌浸润转移中的临床意义需要扩大样本量进行进一步研究。
[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）03（b）-0009-04
Expression of HMGB1 in gastric cancer and its relationship with clinical pathological characteristics
WU Zhen1，2 OUYANG Xiaohui1 SU Xiulan1
1.Clinical Medical Research Center， Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University， Inner Mongolia Autonomous Region， Huhhot 010050， China； 2.Graduate School of Medical Sciences， Baotou Medical College of Inner Mongolia University of Science and Technology， Inner Mongolia Autonomous Region， Baotou 014010， China
[Abstract] Objective To study the expression of HMGB1 in gastric carcinoma and the relationship between the expression and clinicopathological features of gastric cancer. Methods From March 2012 to September 2013， in the First Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University， 104 samples of postoperative pathological diagnosis gastric cancer and their adjacent tissues were selected. Immunohistochemical method was used to detected HMGB1 protein expression， differences of HMGB1 in gastric cancer tissues and adjacent tissues， and its relationship with clinical pathological features of gastric carcinoma were analyzed， the expression of mRNA HMGB1 in gastric cancer cell line SGC-7901， N87， MKN45 and normal gastric mucosal cell line GES-1 were detected. Results Immunohistochemical staining showed that HMGB1 positive particles not only were located in the nucleus， but also in the cytoplasm， and its expression level in gastric cancer tissue was higher than that in gastric cancer adjacent tissue （P < 0.01）. QPCR showed that HMGB1 mRNA in normal gastric mucosal cells was lower than that in poorly differentiated gastric carcinoma cells （P < 0.01）. Conclusion HMGB1 is highly expressed in gastric cancer tissues， especially in poorly differentiated gastric carcinoma and speculated that it may participate in the process of the occurrence and development of gastric cancer， but in gastric cancer invasion and metastasis and its clinical significance need to expand the sample size for further study.
[Key words] HMGB1； Gastric carcinoma； Immunohistochemistry； QPCR
胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一。恶性肿瘤的最基本的生物学特征则是侵袭和转移。学者们一直在致力寻找胃癌恶性程度、侵袭转移的预测及靶向治疗指标。高迁移率族蛋白1（HMGB1）属于高迁移率族蛋白家族，是一种存在于真核细胞内的非组蛋白，广泛参与多种生物学过程，并在多种恶性肿瘤中呈现高表达[1-4]。本文应用免疫组化、QPCR的方法检测其在胃癌组织中的表达及其与胃癌临床病理特征之间的关系，以及其在胃癌各个细胞系的表达。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取内蒙古医科大学第一附属医院2012年3月～2013年9月104例行胃癌根治切除术且术后病理明确诊断为胃癌患者的标本，患者术前均无化疗、放疗史。患者中男76例，女28例，平均年龄（60±14）岁。且每1例胃癌组织样本均有与之相对应的癌旁组织（距离胃癌组织3 cm的组织）作为对照。三种胃癌细胞系SGC-7901、NCI-N87、MKN45及正常胃黏膜细胞系GES-1均由内蒙古医科大学附属医院临床医学研究中心提供。
1.2 免疫组化
用石蜡切片机将石蜡组织块连续切片，制成病理组织切片，厚度为4 μm，采用免疫组化S-P法对HMGB1蛋白进行检测。阳性对照采用已知阳性组织切片，阴性对照以PBS（0.01 mol/L）（pH 7.4）代替一抗进行染色。抗体采用福州迈新生物技术公司生产的兔抗人HMGB1单克隆抗体。
1.3 QPCR
按照说明提取总RNA，Nanodrop 2000/20000分光光度计测定所提取RNA的浓度。各取2 μg RNA逆转录获得cDNA。对目的基因进行扩增，利用QPCR仪7500检测HMGB1在胃癌细胞系SGC-7901、N87、MKN45及正常胃黏膜细胞系GES-1中的表达情况。采用优化两步法反应，先95℃预变性10 min，然后进行PCR反应，95℃变性15 s、60℃退火/延伸1 min，40次循环。
1.4 免疫组化结果判定标准
采用Olympus光学显微镜观察切片。HMGB1蛋白阳性表达定位于细胞核（少量细胞质）。根据镜下所见将染色强度按无色、浅黄色、棕黄色、棕褐色分别评分为：0～3分；高倍镜×400，分别选取5个视野，取其平均值，计算HMGB1阳性细胞表达百分率，按视野下阳性肿瘤细胞所占比例记分≤5 %，6%～25%，26%～50 %，51%～75%，>75%分别为0～4分。染色强度与阳性百分比积分相乘0为（-），1～4为（+），5～8为（++），9～12为（+++）。所有读片均有2名研究者评估，统计学分析组间差异。
1.5 QPCR的Real-time值计算方法
QPCR仪7500检测基因CT值，Real-time值计算按以下公式：ΔCt=目的基因HMGB1的Ct值 -内参基因 GAPDH的Ct值；ΔΔCt=ΔCt-GES-1细胞系组ΔCt的平均值；Real-time值=2-ΔΔCt，取各细胞系的Real-time值用软件统计学分析。
1.6 统计学方法
采用统计软件SPSS 19.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 免疫组化检测HMGB1蛋白的表达
HMGB1表达强阳性为棕褐色，不仅在细胞核中有表达，在细胞质中也有表达（图1～2，封四）。HMGB1在104例胃癌组织中的表达阳性率为83.65%（87/104），高于癌旁组织（66.35%，69/104），差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。
HMGB1表达与胃癌患者性别，年龄，淋巴结转移，肿瘤大小及肿瘤分化程度均无关（P > 0.05）。见表2。
2.3 实时荧光定量PCR检测各胃癌细胞系HMGB1的表达
HMGB1 mRNA的表达水平服从正态分布，在正常胃黏膜细胞中的表达水平及明显低于低分化胃癌细胞中的表达水平，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。分别检测6次后得出结果，GES-1为胃正常黏膜细胞，表达值为1.011±0.168；MKN45为低分化胃癌细胞，表达值为1.266±0.243；N87为高分化胃癌细胞，表达值为0.485±0.157；SGC-7901为低分化胃癌细胞，表达值为3.037±0.472。HMGB1 mRNA在3种胃癌细胞系及正常胃黏膜细胞中的相对表达量的比较结果：GES-1与N87比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；GES-1cSGC-7901比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；MKN45与N87比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；MKN45与SGC-7901比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；N87与SGC-7901比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。因此在低分化胃癌细胞系的表达显著高于正常胃黏膜细胞及高分化胃癌细胞系。
3 讨论
胃癌在我国是一种常见的恶性肿瘤，多种因素，各个环节之间相互作用才导致它的发生[5]。在胃癌的发生和进展过程中，细胞因子对肿瘤微环境的影响不容小觑[6]，其中的一个热点代表就是HMGB1蛋白[7-11]，近年来国内外HMGB1蛋白的研究在肿瘤研究领域引起关注。
高迁移率族蛋白1（HMGB1）是HMG家族成员之一，它是在1973年由Goodwin等[12]发现的一种非组蛋白染色体结合蛋白，得名于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移速度快，其广泛存在于真核细胞内，在真核生物细胞内参与基因转录、DNA损伤修复等多种生物学行为。研究发现肿瘤发生有关基因的转录与HMGB1密切相关，它通过与细胞上相应受体的结合发挥作用，从而能够促进肿瘤细胞的生长、侵袭与转移[13]。有研究表明，在肿瘤细胞坏死的过程中，HMGB1会被释放至局部组织引起相关炎性反应，进而导致更多的正常细胞发生恶变，形成恶性循环，最终导致肿瘤细胞扩散和转移[14]。另外HMGB1还可以参与多种生物学效应，如细胞的增殖分化、新生血管形成和恶性肿瘤的转移等[15-18]。
近期研究已表明HMGB1在多种恶性肿瘤（如胰腺癌[1]、肝癌[2]、大肠癌[3]、鼻咽癌[4]等）的生长增殖和转移过程中异常表达，在新生血管的形成，肿瘤的凋亡耐药及其发展转移的过程中也起着重要作用[19-25]。HMGB1在脓毒症及相关急性肾损伤[23]，心肌梗死及冠心病[26]，老年高血压脑出血[27]中也起着不可忽视的作用。
综上所述，本研究证实了HMGB1在胃癌组织的表达明显高于癌旁组织，在低分化胃癌细胞系的表达显著高于正常胃黏膜细胞，提示HMGB1可以通过多种途径在胃癌的生物学活性中发挥作用。HMGB1作为研究热点代表，其对胃癌的诊断及治疗具有潜在的价值，相信扩大样本量进行进一步研究会得到更加明确的结论。
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