胆碱乙酰酶活性管理论文
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【摘要】目的研究银杏叶提取物(EGb)对点燃模型幼鼠学习记忆等认知功能，对大鼠海马乙酰胆碱酯酶（AChE）、胆碱乙酰转移酶（ChAT）活性的影响。方法21、35日龄SD大鼠各40只，经初筛后随机分为生理盐水对照组、点燃对照组及EGb大、中、小剂量治疗组，采用戊四氮（PTZ）诱导幼鼠点燃模型，以Y型电迷宫及生化检测方法，观察用药前后大鼠学习记忆功能和海马AChE、ChAT活性的变化。结果EGb呈剂量依赖性显著改善实验大鼠的学习记忆能力,并显著抑制海马AChE活性、增强ChAT的活性。结论EGb可以通过抑制功能脑区AChE活性、增加ChAT的活性,增强中枢胆碱能神经系统的功能，改善发育期癫疒间大鼠学习记忆功能。
【关键词】银杏叶提取物；学习记忆；乙酰胆碱酯酶；胆碱乙酰转移酶；点燃模型；大鼠
EffectofextractsofGinkgobilobaleafonthelearning-memoryabilityandtheactivity
ofAChEandChATinthehippocampusinratswithkindling-inducedepilepsy
DUANFangrong,YUANBaoqiang*
(DepartmentofPediatrics,TheAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou,Jiangsu221002,China)
Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofextractsofGinkgobilobaleaf(EGb)onthecognitivefunctionssuchaslearningandmemoryabilitiesandpossiblemechanismsinyoungratswithkindling-inducedepilepsy,andontheactivityofacetylcholinesterase(AChE)andcholineacetyltransterase(ChAT)inrat.Methods40postnatalday21(P21)and40postnatalday35(P35)Sprague-Dawley(SD)ratswererandomlyassignedrespectivelyinto5groups:normalsaline(NS)control,kindlingepilepsymodel,high,middleandlowdosageofEGb-treatedkindlingepilepsyafterpreliminaryscreeningbyY-mazetest.Thekindlingmodelwasestablishedbyanintraperitonealinjectionofpentetrazole(PTZ).Thevariationsoflearning-memoryabilityandtheactivityofAChEandChATinthehippocampuswereobservedbyY-mazetestandbiochemistrydetermination.ResultsEGbcouldobviouslyimprovetheachievementofY-mazetestofthekindlingmodelinadose-dependentmanner,withtheactivityofAChEandChATinthehippocampusinhibitedandincreased,respectively.ConclusionEGbcanimprovelearning-memoryabilityinepilepticratsofdevelopmentalphasebyincreasingtheChATactivityandreducingtheAChEactivity,whichmaycontributetoitsactioninimprovingtheabilityofcholinergicnervoussystem.
Keywords:extractsofGinkgobilobaleaf;learning-memory;AChE;ChAT;kindlingmodel;rats
银杏叶提取物(extractsofGinkgobilobaleaf,EGb)是从银杏叶中利用醇溶液提取出的混合成分，主要含有银杏总黄酮苷、银杏内酯和有机酸等，具有多价性药理作用［1］。其作为一种中枢神经赋活剂，目前国内外已将EGb广泛应用于治疗脑动脉硬化、脑梗死后遗症和老年神经精神症状如注意力不集中、记忆力减退、意识模糊等，在临床上明显地改善了脑功能不全患者的学习记忆能力，因而被认为是一种“认知增强剂”［2-4］。目前认知问题亦是癫疒间儿童在临床诊断和治疗中的常见症状，但尚缺乏较好的处理措施。而关于EGb对癫疒间患者尤其是癫疒间儿童学习记忆等认知功能障碍影响的实验研究或临床研究少见报道。本研究旨在探讨EGb对癫疒间模型幼鼠认知功能的影响及可能机制，为临床应用EGb治疗癫疒间儿童认知功能障碍提供实验依据。
1材料和方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物21、35日龄SD幼鼠，体重55～95g，雌雄不分，由徐州医学院实验动物中心提供。
1.1.2药物及试剂EGb（银杏总黄酮苷＞24%，银杏内酯＞6%，峰比0.8～1.0,银杏酸＜1×10-6%），由徐州富伟生化制品有限公司惠赠；戊四氮(PTZ)购于Sigma公司；AChE、ChAT试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。
1.1.3仪器Y型电迷宫，张家港生物医学仪器厂生产；GL20C超速冷冻离心机，武汉科学仪器厂生产；752紫外分光光度计，上海精密科学仪器有限公司生产;水浴箱，上海医学仪器厂。
1.2方法
1.2.1动物模型的建立参考文献［5］方法。用PTZ亚惊厥剂量（32mg/kg）,腹腔注射,每天1次,连续注射28天。停药1周后,再用相同剂量的PTZ测试。癫疒间发作行为按Racine标准分为6级,即：0级，未发作；Ⅰ级，头面部抽搐；Ⅱ级，肌阵挛、跳起,但无直立；Ⅲ级，肌阵挛,双前肢抬起伴有直立；Ⅳ级，强直-阵挛性惊厥；Ⅴ级，全身强直-阵挛性惊厥伴有翻滚、跌倒。凡显示连续5次2级以上惊厥的大鼠,被认为达到点燃标准，即点燃模型制备成功。
1.2.2动物分组及药物处理先用Y型电迷宫初步筛选21、35日龄大鼠各40只，然后进行点燃模型的制备，造模成功后随机分为5组(n=8)：生理盐水组(NS组)、点燃对照组(PTZ组)、EGb大剂量300mg/kg治疗组(PTZ+EGb1组)、EGb中剂量200mg/kg治疗组(PTZ+EGb2组)、EGb小剂量100mg/kg治疗组(PTZ+EGb3组)。EGb以5%的乙醇为溶剂制备成10%的混悬液，采用灌胃给药,NS组和PTZ组给予相同体积的生理盐水,每日1次，连续给药7天。所有大鼠均在同一实验室和动物中心操作和饲养，以保持喂养、光照、噪声等条件相同。
1.2.3学习记忆功能的训练与评定参照王跃春［6］方法，电流强度0.7mA，电压50V，电击延时5s。
筛选：将大鼠放入Y型迷宫箱中适应3min后，给予适当电击，至其对3臂均探索进入为止，选择活跃、对点击反应较敏感、逃避反应迅速者供测试用。淘汰反应过于迟钝或特别敏感的大鼠。
训练及评定：采用随机休息不固定训练次数法，以大鼠在足底通电后15s内一次性进入安全区的反应为正确,直至大鼠在连续10次电击中有9次或以上正确（9/10标准）为达到学会标准，以每只大鼠达学会标准所需电击次数表示大鼠的学习记忆成绩。所有训练在1个实验日内完成。各组在造模后次日及治疗后7天进行认知功能的评定。
1.2.4海马AChE、ChAT活性的测定在完成认知功能评定步骤后断头处死大鼠,冰台上迅速取脑并剥离海马,用滤纸吸去海马上的血液,精密称重,脑重∶生理盐水以1∶9比例加入4℃生理盐水制成脑匀浆,3000r/min离心10min,取上清液待测。
海马AChE、ChAT活性的测定严格按试剂盒说明进行，752型紫外分光光度计进行比色。脑组织蛋白测定采用考马斯亮兰试剂盒。
设定每毫克组织蛋白样本在37℃保温6min,水解反应体系中1μmol基质为1个AChE活力单位；在pH7.2条件下，25～30℃时每分钟转移1nmol乙酰胆碱的能力定义为一个ChAT活力单位。
1.3统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行数据处理，所有计量资料数据以±s表示；多组间的比较采用单因素方差分析(One-WayANOVA)，治疗前后的比较采用配对t检验（Paired-SamplesTTest）,不同日龄组的比较采用独立样本t检验(Independent-SampleTTest)；P<0.05认为差异有统计学意义。
2结果
2.1点燃模型的建立PTZ腹腔注射1周左右大鼠陆续出现程度不等的疒间性发作,为Ⅰ～Ⅲ级,以后发作程度逐渐加剧,在连续注射28天后所有大鼠均达到点燃标准。大鼠的疒间性发作基本上在每次腹腔注射PTZ后5～6min出现,一般在10min左右达到高峰,高峰过后时而表现安静,时而有阵发性阵挛,一般30min后很少再有抽搐发作。PTZ点燃成功的大鼠,有慢性、自发性、复发性的发作过程。
2.2各组大鼠行为学测试Y型电迷宫测试结果见表1。
2.2.1治疗前不管是21日龄还是35日龄的大鼠，PTZ各组与其同龄NS组相比，达到学会标准所需的电击次数明显增多(P<0.01)，而PTZ各组之间没有明显差异(P>0.05)；21日龄与35日龄的PTZ各组相互比较，前者达标次数亦明显增多(P<0.05);21日龄与35日龄的NS组相互比较差异无统计学意义。表1各组大鼠Y型电迷宫试验达标所需电击次数与NS组比较：*P<0.01；与治疗后PTZ组比较：#P<0.01；与PTZ+EGb2组比较：P<0.01；与同组治疗前比较：P<0.05；与21日龄组比较：P<0.05。
2.2.2治疗后2个日龄EGb治疗组达到学会标准的次数均明显少于同龄PTZ组(P<0.01)；同龄EGb大、中、小剂量治疗组相互比较,达到学会标准的次数随EGb治疗剂量的减少逐渐增多，呈现剂量依赖性递增(P<0.01)；各EGb组的2个年龄段之间却未示明显差异(P>0.05)。
21日龄、35日龄各组治疗前后相互比较，EGb各剂量治疗组治疗后达标次数均明显少于治疗前(P<0.01或P<0.05)；NS组、PTZ组治疗前后差异无显著性统计学意义。
2.3生化检测不管是21日龄还是35日龄的大鼠，PTZ组与各自的NS组比较，海马AChE、ChAT的活性都明显降低(P<0.01)；各EGb治疗组与其同龄PTZ组相比，随治疗剂量的增加，AChE活性逐渐降低、ChAT活性则逐渐提高，呈剂量依赖性(P<0.01)；各组的2个年龄段之间AChE、ChAT的活性均未示明显差异(P>0.05)。见表2。表2各组大鼠海马AChE、ChAT活性的比较与PTZ组比较：P<0.01；与PTZ+EGb2组比较：P<0.01；与21日龄PTZ组比较：P>0.05
3讨论
点燃模型作为一种最常用的癫疒间动物模型,具备慢性、自发性和复发性特征,点燃一旦建立,动物的这种脑细胞及惊厥行为敏感性可长期维持及至终身,较好地模拟了人类癫疒间的进行性发展和长期反复的自限性发作形式。许多研究表明，不同形式癫疒间发作过程中常伴有海马结构内选择性神经元脱失、苔藓纤维出芽(sprouting)和特异性突触重建等形态学改变［7-9］，在人类复杂部分性发作和儿童期癫疒间患者亦可观察到同样的变化［10］,这表明点燃与人类癫疒间的形成可能有共同的机制，因此点燃模型是研究慢性癫疒间较理想的动物模型。临床资料显示癫疒间患者中30%～40%存在认知功能障碍［11］，在儿童患者更为显著，临床上表现为某种程度的学习困难或学习不能、语言能力的损伤等，但临床上对此缺乏有效的手段来改善这一现状。
本实验采用戊四氮化学点燃方法,复制出了接近人类癫疒间的慢性癫疒间模型，本实验的行为学观察结果发现:点燃组大鼠学习记忆能力显著低于NS组,与文献报道结果相似，说明本造模法稳定可靠,适用于学习记忆等高级神经功能活动的研究。试验结果还显示，21日龄模型鼠的行为学指标与35日龄的相比，差异具有显著性，与以往研究结果相一致，即癫疒间幼鼠起病越早，对学习记忆等认知功能损伤越严重［12］。
目前认为中枢胆碱能系统与学习记忆功能的关系极为密切，有资料表明,海马的胆碱能系统直接参与信息的储存和回忆。而AChE及ChAT是胆碱能神经元的标志酶，两者共同维持着中枢胆碱能系统重要的神经递质——乙酰胆碱（ACh）的动态平衡,在多种高级脑功能包括学习记忆过程中发挥重要作用，所以用AChE及ChAT的活性来反映胆碱能系统的功能较为可靠。许多药理学及临床研究已证实海马和新皮层的胆碱能损伤可以损害大鼠和人的记忆功能。我们的研究显示,点燃大鼠的学习记忆能力明显减退,同时伴有海马AChE、ChAT活性降低,提示戊四氮诱导的学习记忆障碍与海马及新皮层胆碱能系统的功能降低有关，这与以往的研究结果一致。在应用银杏叶提取物EGb治疗后发现，EGb显著改善了癫疒间鼠的学习记忆功能，还显著降低AChE的活性，增强ChAT的活性，并且在100～300mg/kg范围内，EGb的这种药理作用呈剂量依赖性增强。表明EGb能改善癫疒间大鼠学习记忆功能的机制可能与抑制脑AChE活性、增加ChAT的活性,从而提高ACh含量,增强中枢胆碱能神经系统的功能有关。诸多的研究显示，EGb还可能通过促进大脑海马胆碱的再摄取、减少M型胆碱受体和肾上腺素受体及递质的丢失、促进大脑循环代谢、增强胆碱能神经元神经营养因子受体的敏感性等途径发挥改善学习和记忆能力的功能［13］。近年来的临床研究也发现EGb可明显改善血管痴呆患者的智能障碍，这种作用可能与EGb加速神经冲动的传导,易化突触传递,从而有利于信息获得、记忆巩固和再现有关［14］。本实验中2个不同年龄段对应组间生化指标比较未示显著差异，说明除胆碱能系统外可能还有其他机制影响癫疒间幼鼠的学习记忆功能。
本实验结果提示：EGb可以通过抑制学习记忆功能脑区AChE活性、增强ChAT活性、增强中枢胆碱能神经系统的功能来改善点燃模型幼鼠的学习记忆功能障碍，为EGb用于临床治疗癫疒间儿童认知功能障碍提供了理论和实验依据，并且进一步拓展了EGb的药用价值。
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