贵州省烟草赤星病病原菌的鉴定

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摘要：2014年6～10月在贵州烟草主栽区对烟草赤星病病原菌进行了分离鉴定，鉴定出2种病原菌，即链格孢菌（Alternaria alternata （Fr.） Keissler）和长柄链格孢菌（Alternaria longipes（ELL.&Ev）Mason）。

关键词： 烤烟； 烟草赤星病； 病原菌鉴定

中图分类号：S432.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）15-3656-03

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2015.15.017

Abstract： From June to October in 2014， pathogenic fungi of tobacco brown spot was separated and identified in tobacco′s main area in Guizhou. 2 kinds of pathogenic fungies had been obtained，which were Alternaria alternata （Fr.） Keissler and A. longipes （ELL & Ev） Mason.

Key words： flue-cured tobacco； tobacco brown spot； pathogenic identification

烟草赤星病于1892年在美国首先被发现，1931年从发病的感染叶片中筛选出其病原交链孢菌（A. longipes（ELL.&Ev）Mason），1971年定名为（Alternaria alternata （Fries） Keissler）[1，2]。赤星病具有潜伏期短、流行速度快的特点，在环境有利于发病的情况下，短时间内即可造成大面积流行，给烟叶生产带来巨大损失。在贵州烟区，通过2004～2008年的调查，全省平均病情指数为1.56，发病较重的年份平均病情指数高达2.51，年度重发病烟区常常造成毁灭性灾害。贵州省常年植烟总面积近20万hm2，每年因赤星病造成的烟叶产值损失平均达2 500多万元[3，4]。为了更好的防治烟草赤星病，本研究对贵州烟草赤星病进行了病原菌的鉴定。

1 材料与方法

1.1 调查时间和地点

2014年6～10月在贵州烟草主栽区天柱县、开阳县、威宁县、道真县、兴义县、普定县等地进行调查。

1.2 病害标本采集

采集到病害症状典型的叶片立即拍照、编号、记录采集人、时间、地点及主要发病特征，并将标本放入经过灭菌的信封中带回实验室。

1.3 病原菌的分离纯化

在病部有明显病征处直接挑取菌丝进行分离培养，观察有分生孢子器并产生大量分生孢子的，用单孢分离法分离病原菌。对于没有明显病征的，采用常规分离方法进行病原菌的分离。

1.3.1 单孢分离法 参考邱小燕等[5]的单孢分离法并加以改进。具体方法为，先用75%乙醇消毒30 s后，用无菌水清洗3次。之后用镊子夹起病斑，置于灭菌滤纸上吸干多余水分，再用剪刀将病斑部分剪下边长约2 mm小块。用灭过菌的手术刀将病斑小块在干净的培养皿内切碎，然后将其转至1.5 mL离心管内，加入1 mL无菌水配成孢子悬浮液，再吸取60 μL孢子悬浮液均匀涂布于加入双抗的PDA平板上。适宜温度下倾斜放置12 h，最后在10/40倍显微镜下挑取萌发的单个孢子于加入双抗的PDA平板上。

1.3.2 组织分离法 病部叶组织表面经消毒后，切取病叶交接处的组织，移在PDA上培养。表面消毒可用升汞水或用火焰灼烧（不影响组织内的病原），最常用的消毒方法是在75%的乙醇中浸过后将乙醇挥发掉。

1.3.3 病原菌的纯化 切取或挑取分离得到的培养物边缘较纯的部分于新的平板培养基上，如此反复几次，得到病原菌的纯培养。

1.4 病原菌的鉴定

以传统的形态学鉴定为主，对于形态学难以鉴定的疑难属、种，结合分子生物学方法进行鉴定。

1.4.1 病原菌形态特征观察 对分离得到的病原菌，观察其在PDA上的培养性状，包括菌落的形状、大小、颜色等，观察菌丝及分生孢子的形态特征，描述其形态，并测量大小，进行显微拍照等。然后根据病害组织的症状，结合病原菌形态特征进行病原菌鉴定[6，7]。

1.4.2 病原菌的分子生物学鉴定 用CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）法提取病原菌的总DNA，具体步骤如下：①收集培养4～7 d的菌丝约0.2 g，在液氮中迅速研磨成粉末后，把粉末转入1.5 mL的离心管中，然后加入700 μL 2%CTAB（2%PVP，100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，25 mmol/L EDTA，2.0 mol/L NaCl）缓冲液，混合均匀；②于65 ℃水浴锅中加热1 h，期间轻轻摇匀3次；③从水浴锅中取出，冷却至室温后，加入等体积（700 μL）的氯仿∶异戊醇（24∶1），颠倒混匀10 min，4 ℃ 10 000 r/min离心10 min，吸取上清液转入另一离心管；④在上清液中加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10～20 min；⑤4 ℃ 10 000 r/min离心10 min，倒出上清液；⑥用200 μL 75%乙醇洗涤2～3次除盐（可置于-20 ℃冰箱中过夜）；⑦37 ℃干燥20 min，沉淀回溶于600 μL ddH2O中，并用等体积的饱和酚（Tris平衡酚）∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提1～3次，4 ℃ 10 000 r/min离心10 min，将上清液转至另一离心管中；⑧用等体积氯仿∶异戊醇（24∶1）抽提1～3次，4 ℃ 10 000 r/min离心10 min，吸取上清液；⑨于上清液中依次加入1/10体积的4 mol/L的NaAc溶液、2倍体积的无水乙醇，静置20 min后，4 ℃10 000 r/min离心5 min，收集沉淀DNA；⑩沉淀用200 μL 75%乙醇洗涤2～3次，干燥后溶于适量ddH2O中，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.4.3 PCR及测序 利用真菌核糖体rDNA转录间隔区（ITS）PCR扩增的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）对提取的总DNA进行PCR扩增，引物由上海捷瑞生物工程技术服务有限公司合成。

PCR扩增反应体系为：9.5 μL ddH2O，12.5 μL 2×Taq MasterMix[天根生化科技（北京）有限公司]，正反引物各1 μL，模板DNA 1 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃充分延伸7 min，4 ℃保存。

PCR扩增产物的检测及测序：经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，BIOCRAD凝胶成像系统观察、拍照、保存。将产物送至北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序，测序结果经BLAST与NCBI数据库中的已知序列进行同源性比较。根据同源性比较结果，结合病原菌的形态学特征，鉴定出病原菌。

1.5 回接试验

供接种的离体叶片来自贵州省烟草科学研究所，品种为云烟87。将健康新鲜叶片进行75%乙醇表面消毒，并用无菌水冲洗，用大头针（高温灼烧消毒）在叶片两侧的叶基处、叶中部、近叶尖处共6处刺穿，叶片在2×106 个孢子/mL孢子悬浮液中浸泡30 s后沥干（对照叶片在无菌水中浸泡30 s后沥干），将叶片置于2层滤纸上，于26 ℃光照培养箱内保湿培养5 d。记录回接结果，并对回接发病的组织进行症状观察记录和病原菌的分离，如果回接发病组织的症状与烟草赤星病症状相同或相似，且分离得到的培养物与之前回接上去的一致，则确认此菌为烟草赤星病的病原菌。

2 结果与分析

经形态学与分子生物学综合鉴定分析，病原菌有2种，一种为链格孢菌，另一种为长柄链格孢菌，这两种菌均为半知菌亚门链格孢属。

2.1 链格孢菌

形态特征：菌落圆形，正面黑色，疏松，产生圈状的轮纹，发病叶片保湿12 h后有菌丝产生，出现少量煤层。光学显微镜观察发现，产孢1 d后的未成熟孢子椭圆形，无色或浅黑色，单孢。4～5 d后分生孢子成熟，棕黑色，倒梨状，有1～7个横隔，0～3个纵隔，孢子呈珠串状或放射状，每条链上的分生孢子不超过5个。有些分生孢子会产生假喙，有些假喙比孢身长。成熟的分生孢子大小为29.2 μm× 11.2 μm（图1）。

分子生物学鉴定：以菌株HGUP1606（病叶分离得到）基因组DNA为模板，以ITS1和ITS4引物进行PCR扩增，产物送至北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序，得到HGUP1606的ITS区序列，经BLAST并与NCBI数据库中的已知序列进行同源性比较，鉴定结果为链格孢菌。

2.2 长柄链格孢菌

形态特征：菌落圆形，正面黑色，疏松，产生圈状的轮纹，发病叶片保湿12 h后产生大量煤层。菌落在PDA上与PCA上有很大的差别，在PDA上菌落也是圆形，但是轮纹不明显。菌落上还出现白色的菌丝。在烟叶上的孢子与PCA上的孢子更加相近，PDA上的营养物质与烟叶本身相差较大，因此在PDA上产生的分生孢子与前两者有一定的差异性。光学显微镜观察发现，4～5 d后分生孢子成熟，棕黑色，倒梨状，有1～7个横隔，0～3个纵隔，孢子呈珠串状，无假喙，呈单链，每条链上有4～10个孢子。成熟的分生孢子大小为29.6 μm×10.9 μm（图2）。

分子生物学鉴定：以菌株A225基因组DNA为模板，以ITS1和ITS4引物进行PCR扩增，产物送至北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序，得到菌株A225的ITS区序列，经BLAST并与NCBI数据库中的已知序列进行同源性比较，鉴定结果为长柄链格孢菌。

2.3 回接鉴定

经回接保湿培养5 d后，能产生烟草赤星病的典型症状，并重新分离分别得到链格孢菌和长柄链格孢菌2种病原菌。

3 小结

通过对贵州烟草主栽区烟草赤星病真菌病害调查及标本采集和病原菌的分离鉴定，得到贵州烟草赤星病上2种病原菌，但是欠缺的是并没对2种病原菌进行进一步病原菌致病力强弱的研究，同时有关报道称烟草赤星病病原菌有第三个种[8]，但是在贵州并未发现，有待进一步调查研究。

参考文献：

[1] LUCAS G B. Alternaria alternata （Fries） Keissler， the correct name for A. tenuis and A. Longipes[J].Tobacco Science，1971， 15：37-42.

[2] NORSE D. Some factors influencing spore germination and penetration of Alternaria longipes[J]. Annals of Applied Biology，1973，74（3）：297-306.

[3] 徐亚中，谢德平，李花亭，等.烟草赤星病发生流行规律和药剂防治研究[J].中国烟草，1993（1）：18-21.

[4] 刘许生，孔繁武，廖和平.烤烟赤星病发生与气象因子的关系及预测模式建立[J].江西植保，2005，28（4）：152-153.

[5] 邱小燕，汤智鹏，张 敏，等.一种适用于多数植物病原真菌的单孢分离方法[J]安徽农业科学，2011，39（9）：5263-5264.

[6] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979.

[7] 方中达.植病研究方法[M].第3版.北京：中国农业出版社，1998.

[8] 彭希文，刘光珍，杨永柱，等.云南省烟草赤星病（Tobacco brown spot）病原研究及其防治药剂的筛选[J].西南农业大学学报，2000，22（2）：153-156.