帕金森病病人USP24基因外显子39～68突变筛查
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【关键词】 帕金森病;usp24基因;突变
【摘要】 目的 对帕金森病(pd)病人泛素?特异性蛋白酶24(usp24)基因的外显子(exon)39～68进行突变筛查，以进一步了解usp24基因是否为pd的致病基因。方法 对中国湖南省92例散发pd病人usp24基因的exon39～68通过pcr产物直接测序法进行突变筛查。结果 在exon39～68中未见任何碱基变异，在外显子?内含子交界区检测出11种变异，其中3种为已知多态(rs6588545、rs12031876和rs10493176)，位于exon59的c.7078+22 a>g变异仅在1例以强直为主要临床症状的早发男性pd病人中存在，在95例正常人中不存在此变异。结论在湖南地区的中国人群中，usp24基因位于exon39～68的基因突变可能在pd的发病机制中不起主要作用。
【关键词】 帕金森病;usp24基因;突变
mutation screening of usp24 gene exon in patients with parkinson disease mo xiao?yun, chi jing?wei, li xiao?ping, et al (state key laboratory of medical genetics of china, central south university, changsha 410078, china); [abstract] objective to screen the exon39-68 of usp24 gene in patients with parkinson disease (pd) and further understand whether it is the cause of the condition. methods mutation screening of exons39-68 of usp24 was undertaken in 92 sporadic pd patients of hu′nan. results no any basic variations were detected in exons39-68; 11 variants were identified in the exon?intron boundaries, in which, three of them were known polymorphisms (rs6588545, rs12031876 and rs10493176). the mutation locating at c.7078+22 a>g of exon59 was found in only one early?onset male patient with main clinical symptom of stiffness, this variation was not found in 95 normal persons. conclusion the mutation locating in exon39-68 of usp24 gene seems not to play a principal role in pathogenesy of parkinson disease in chinese population of hu′nan region.
[key words] parkinson disease; usp24 gene; mutation
帕金森病(pd)是一种常见神经退行性疾病，遗传因素是其重要致病原因，迄今已定位了16个pd遗传易感位点，泛素?特异性蛋白酶24(usp24)基因位于pd的park10遗传易感位点[1]。li等[2]采用25个单核苷酸多态(snp)对pd病人usp24基因进行病例?对照研究，发现其中6个snp在病人组与对照组间存在显著差异。尽管遗传学研究发现usp24基因可能参与pd的发病，但现有的研究仅用usp24基因相关的snp在pd病人与正常人间做关联分析，并未在pd病人中对usp24基因进行突变筛查。本研究首次在pd病人中对usp24基因的部分外显子(exon39～68)进行突变筛查,进一步分析usp24基因是否参与pd的发生。
1 对象与方法
1.1 对象
1.1.1 pd病人组 来自中国湖南省的汉族散发pd病人92例，由中南大学湘雅医学院神经内科唐北沙教授课题组收集，所有病人均经过至少2名经验丰富的神经内科医生严格的神经系统检查，诊断严格依据1992年英国脑库原发性pd诊断标准[3]。92例病人中，男53例，女39例;年龄为18～70岁，平均(53.14±14.96)岁;起病年龄为13～68岁，平均(48.43±15.04)岁;病程平均为(4.3±3.2)年。其中41例为早发性pd，起病年龄<50岁;51例为迟发性pd，起病年龄>50岁。82.61%的病人存在震颤症状，79.35%的病人存在肌强直症状，40.22%的病人临床上出现姿势反射受损，59.78%的病人存在运动过缓表现。其中33例病人临床表现以震颤为主，24例临床表现以强直为主。所有病人均在用药前采用hoehn?yahr scale score分期(hoehn?yahr)以及pd运动总分评级量表(updrs ⅲ)来评估病人的病情严重程度及运动系统受损状况，本组病人的平均hoehn?yahr评分为(2.34±0.87)分，平均updrs ⅲ评分为(27.27±15.43)分。在早发pd病人中，parkin、pink1与dj?1基因均无突变(结果来源于唐北沙教授课题组)。
1.1.2 正常对照组 95例，分别由医学遗传学国家重点实验室及中南大学湘雅医院收集。其中男50例，女45例;平均年龄为(52.17±13.32)岁。性别、年龄、居住地、民族分布均与pd病人组相匹配。
1.2 方法
1.2.1 外周血gdna抽提 常规采集两组外周静脉血10 ml，受检者均签署知情同意书。常规苯酚?氯仿法抽提外周血淋巴细胞gdna。
1.2.2 引物设计 对usp24基因exon39～68以及这些外显子与内含子的交界区进行pcr扩增。采用primer 3.0在线软件(www?genome.wi.mit.edu/cgi?bin/primer/primer3.cgi/)设计相应的pcr引物(序列见表1)，引物由上海博亚生物技术有限公司合成。表1 usp24基因突变检测引物序列外显子正向引物反向引物
1.2.3 pcr反应条件 采用热启动pcr反应程序在10 μl反应体系中扩增各对引物，反应体系如下： 5×106 u/l的hotstar polymerase (qiagen公司)0.25 μl，10 mmol/l dntps 0.2 μl，30 mg/l引物每条1.0 μl，30 mg/l dna 模板 1.0 μl，10×buffer 1.0 μl，q buffer 2.0 μl，mgcl2 0.5 μl，补去离子水至10 μl。多数引物的pcr反应程序为：第一相循环，95 ℃预变性15 min，94 ℃变性50 s, 65 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，循环6次，每个循环退火温度下降1 ℃;第二相循环，94 ℃变性50 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，循环25次，72 ℃延伸5 min。取pcr产物2.0 μl用60 g/l聚丙烯酰胺凝胶电泳40 min，并银染检测，对扩增特异性好的pcr产物用虾碱性磷酸酶和核酸外切酶(fermant公司)37 ℃酶切90 min, 80 ℃ 15 min灭活虾碱性磷酸酶和核酸外切酶，将处理后的pcr产物使用3100基因分析仪(abi公司)进行测序。测序结果用dnastar软件中的seqman程序与参照序列(genebank accession number：nm_015306.2)进行比对分析。
1.3 统计学分析
使用spss 13.0统计学软件包中的fisher’s exact test分析等位基因频率和基因型频率在两组间的差别，以p<0.05为差异具有显著性。
2 结 果
在30个外显子(exon39～68)中未发现任何碱基变异，仅在外显子?内含子交界区检测到11种变异，见表2。其中，位于exon57的c.6882+71 a>t，位于exon59的c.6976?39 c>t及位于exon65的c.7527?18 a>g的3个变异均为dbsnp数据库中已报道的snp，其snp分别是rs6588545、rs12031876和rs10493176，其余变异均为dbsnp数据库中未报道的变异。所有变异或多态在病人中均以杂合状态出现。pd病人中这3个位点的基因型及等位基因频率与dbsnp数据库报道的正常人的基因型及等位基因频率并没有差别(见表3)。位于exon59的c.7078+22 a>g变异仅在1例以强直为主要临床表现的早发男性pd病人中检测到，在95例正常人中并未发现此变异。
3 讨 论
尽管pd的发病机制还不清楚，但目前认为遗传因素与环境因素的共同作用导致pd的发生。迄表2 pd病人中usp24基因exon39～68突变检测结果外显子变异 dbsnp数据库录入号 变异频率表3 pd病人与正常人中usp24基因rs6588545、rs120今，在基于家系连锁分析的基础上已定位了16个pd遗传易感位点，克隆了11个pd致病基因，如：snca[4]、parkin[5]、lrrk2[6]、pink1[7]以及atp?13a2[8]等。
已有研究结果证实，usp24基因位于park10位点[9]。由于usp24基因是泛素?特异性蛋白酶家族的成员，具有将多聚泛素从靶蛋白上移走，防止靶蛋白被蛋白酶降解的功能，而蛋白酶解及蛋白聚集是pd发病的重要机制，因此usp24基因有可能参与pd的发生。li等[2]运用snp进一步的病例?对照研究结果显示，usp24基因与pd的发生有关。以上两项研究均提供了usp24基因可能参与pd致病的遗传学依据，但由于病例?对照研究的结果并不精确，它提示真正的致病变异可能与这些snp存在连锁不平衡，也可能是这些snp本身参与pd的致病，因此，对于usp24基因是否真的参与pd的发生，还需要对该基因的蛋白编码区、5′及3′utr区、甚至启动子和增强子、沉默子进行突变筛查分析，以明确pd病人中该基因在上述对基因功能起关键作用的区域是否存在变异。由于usp24基因的存在于2005年才得以证实，目前对它的启动子和增强子、沉默子所在区域还尚未确定，甚至近几年来它的外显子也是逐步被证实为目前的68个，因此，在我们第一阶段的研究工作中，先完成了对该基因exon39～68共30个外显子的突变筛查。
尽管li等[2]的研究仅选择了迟发的散发pd病人进行了病例?对照分析，但oliveira等[1]在2005年的研究中，既纳入早发病人，也纳入迟发病人，因此在我们的研究中既包括了早发的pd病人，也包括了迟发的pd病人。
本研究在对pd病人的usp24基因exon39～68的突变筛查中，并未发现外显子的任何变异，仅在外显子?内含子交界区检测到11种变异，可见该基因的exon39～68蛋白编码区非常保守，也可能提示这段序列对维持usp24基因的功能非常重要。尽管我们的样本相对较小，但也在一定程度上提示usp24基因的30个外显子(exon39～68)的基因突变可能在中国人群中对pd的发病不起主要作用。未来，我们还需要对usp24基因的exon1～38进行突变筛查，以进一步了解该基因5′端的38个外显子有无氨基酸改变。目前我们所获得的exon39～68突变筛查阴性结果的数据也可能是以下原因所造成。首先，我们的样本量相对较小，还不能很好地代表中国汉族pd病人的情况，在下一阶段的研究中还应该纳入更多的pd病人;其次，不论是li等[2]还是oliveira等[1]的研究样本均来自高加索白人，而我们的样本为中国湖南汉族人，不能除外种族异质性对usp24基因的影响，因此有必要在其他人种中对usp24基因进行突变筛查;最后，尽管我们在95例正常人中并未发现c.7078+22 a>g变异，但95例正常人的样本量仍相对较小，有必要扩大正常人样本量再次对该snp进行病例?对照研究。同样，在外显子?内含子交界区检测到的其他10种变异，也有必要进行病例?对照分析，对于那些在病人与正常人中分布频率不同的变异还需要进行下一步的功能研究，例如进一步明确那些位于剪切位点附近的变异是否有可能影响毗邻外显子的剪切。
综上所述，usp24基因的exon39～68基因突变可能在中国湖南地区pd病人的发病机制中不起主要作用。
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