平卧菊三七中绿原酸提取及纯化工艺的优化
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摘要：采用超声醇提法从平卧菊三七（Gynura procumbens）中提取绿原酸，设计正交试验考察乙醇体积分数、料液比、pH、超声功率对绿原酸提取率的影响。通过静态吸附—解吸试验优选适合绿原酸纯化的大孔树脂，并运用单因素试验优化动态吸附—解吸条件。结果表明，最佳提取工艺条件为乙醇体积分数70%、料液比1∶15（m∶V，g/mL）、pH 4、超声功率120 W，此条件下绿原酸得率为3.13%。HPD600型树脂对绿原酸有较高的吸附率和解吸率，优化后的吸附条件为上样流速2 mL/min、pH 3；适宜的洗脱剂为体积分数30%和50%的乙醇，纯化后绿原酸的纯度为77.4%。
关键词：平卧菊三七（Gynura procumbens）；绿原酸；提取；纯化
中图分类号：R284.2；S567.23+6 文献标识码：A 文章编号：0439—8114（2012）19—4348—04
平卧菊三七（Gynura procumbens （Lour） Merr.）为菊科三七属多年生草本药食两用植物[1]，近代药理研究表明其具有降压[2，3]、降糖[4，5]、降脂[5]、抗氧化[6]、消炎[7]、抗癌[8，9]等功效。其主要活性成分有绿原酸、黄酮类、生物碱、萜烯类、香豆素类等[10—13]。绿原酸是植物在有氧呼吸过程中由磷酸戊糖途径（HMS）的中间产物合成的一种苯丙素类物质，它包括绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、莱蓟素等十多种同分异构体，具有抗菌、抗病毒、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、降糖、清除自由基等作用，是保健品、食品、药品及化妆品的重要原料。绿原酸在植物界广泛存在，在忍冬科和菊科植物中含量较高[14—17]。本研究采用超声波醇提法从平卧菊三七中提取绿原酸，并选用吸附容量大、选择性好、吸附迅速、解吸容易、再生简单的大孔树脂对其进行纯化，以期为进一步开发利用平卧菊三七提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
平卧菊三七叶采自江西农业大学中药园，烘干粉碎后过60目筛，装袋备用；绿原酸标准品由湖南浏阳艾特天然产物研究与开发有限公司生产；无水乙醇、盐酸、氢氧化钠均为分析纯；大孔树脂AB—8、S—8、NKA—2、NKA—9、X—5、HPD600、D101、H103均购于沧州宝恩吸附材料科技有限公司。
UV—754型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；LXJ—ⅡB低速离心机（上海安亭科学仪器厂）；KQ3200DB型台式数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；pH计（Thermo电子公司）；恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）；小型粉碎机（长沙市常宏制药机械设备厂）；ZHWY—1102型摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 超声波辅助乙醇浸提法提取绿原酸 ①提取工艺流程。称取1 g左右平卧菊三七叶样品粉末加入适量石油醚挥干备用超声波辅助乙醇提取离心取上层清液定容至25 mL吸取1 mL溶液定容到25 mL容量瓶，得平卧菊三七提取液[18]。②绿原酸标准曲线的绘制[19]。称取绿原酸标准品5 mg，用70%（体积分数，下同）的甲醇溶液定容于25 mL的容量瓶，配制成200 μg/mL的标准溶液，然后用移液管分别取上述标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于25 mL容量瓶中，用70%的甲醇溶液定容，配成浓度分别为8、16、24、32、40 μg/mL的标准溶液，用紫外可见分光光度计在波长328 nm下测定吸光度，得到绿原酸标准溶液浓度（X//μg/mL）与吸光度A328 nm（Y）的回归方程为Y=0.041 3X—0.015 7，R2=0.999 6（图1）。③正交试验优化绿原酸提取工艺。设计正交试验考察pH、料液比、超声波超声功率和乙醇体积分数对平卧菊三七中绿原酸提取率的影响，正交试验因素与水平见表1。
1.2.2 大孔树脂纯化绿原酸
1）工艺流程。平卧菊三七提取液依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取得水相液作为样液上样于大孔树脂不同体积分数的乙醇进行梯度洗脱接绿原酸含量最高的洗脱液旋转蒸发浓缩洗脱液除去乙醇冷冻干燥得绿原酸粗品。
2）树脂的预处理[20]。各种树脂分别用双蒸水溶胀、浮选后，在1 mol/L NaOH溶液中浸泡4 h，用双蒸水洗至中性；然后用0.5 mol/L HCl溶液浸泡24 h，不断搅拌，用双蒸水洗至中性；再在70%（体积分数，下同）的乙醇溶液中浸泡24 h并不断搅拌，用去离子水洗至无白色浑浊、无乙醇味后用双蒸水浸泡待用。
3）树脂的静态吸附与解吸试验。①静态吸附。准确称取预处理好的树脂1 g，装入150 mL磨口三角瓶中，加入50 mL已测定浓度的样液，盖紧瓶塞，在25 ℃恒温水浴摇床上振摇24 h，充分吸附后过滤，测定吸附液中绿原酸的浓度，按式（1）和式（2）计算吸附量Q和吸附率E。②静态解吸。将完成吸附的树脂过滤后放入150 mL磨口烧瓶中，加入50 mL 70%的乙醇，在25 ℃恒温水浴摇床上振摇24 h，收集洗脱液，测定吸光度，按式（3）计算解吸率D。
Q=■ （1）
E=■×100% （2）
D=■×100% （3）
式中，Q为吸附量（mg/g）；C0为绿原酸样品的初始浓度（mg/mL）；Ce为吸附后样液中绿原酸的浓度（mg/mL）；V为吸附液体积（mL）；W为树脂质量（g）；C2为解吸液的浓度（mg/mL）；V2为解吸液体积（mL）。
4）树脂的动态吸附与洗脱试验。①上样流速对泄漏率的影响[21]。把处理好的树脂装入吸附柱，上样液流速分别为2、4、6、8、10 mL/min，分别收集不同流速下的流出液，按式（4）计算泄漏率。②上样液pH对动态吸附的影响[21]。分别调节上柱液的pH为2、3、4、5、6，以一定的流速进行动态吸附，收集流出液，检测其中绿原酸的含量，计算其吸附率。③梯度洗脱曲线的绘制。取50 mL的树脂装柱，调节提取液pH为3，按流速2 mL/min上样进行吸附。待吸附完全后，依次用去离子水和体积分数分别为10%、30%、50%、70%、90%的乙醇水溶液各5 BV进行洗脱，分别收集每BV洗脱液，测定吸光度，绘制梯度洗脱曲线。
泄漏率=■×100% （4）
2 结果与分析
2.1 正交试验结果
平卧菊三七中绿原酸提取工艺的正交试验结果见表2，利用DPS软件进行极差分析、方差分析和Duncan’s新复极差法进行多重比较，优选出超声波辅助醇提法提取平卧菊三七中绿原酸的最佳工艺参数。结果表明，各因素对绿原酸提取率的影响由大到小依次为料液比、乙醇体积分数、pH、超声功率。其中料液比、乙醇体积分数和pH对绿原酸提取的影响极显著，超声功率的影响不显著。最佳提取工艺为A3B1C2D2，即pH 4、料液比1∶15（m∶V，g/mL）、超声功率120 W、乙醇体积分数70%，在此条件下进行验证试验，得到绿原酸的平均提取率为3.13%，高于正交试验组合的最高值，说明该结果是可靠的。
2.2 树脂的静态吸附与解吸试验结果
表3为8种树脂对绿原酸的吸附和解吸效果。从表中可以看出，S—8、H103、HPD600的吸附率高于其他5种树脂，而HPD600的解吸率远高于其他类型的树脂，考虑到绿原酸的极性与大孔树脂的吸附解吸特性，HPD600树脂为适合用于绿原酸纯化的树脂。
2.3 HPD600树脂的动态吸附与洗脱试验结果
2.3.1 上样流速对泄漏率的影响 上样流速影响吸附质向树脂表面的扩散，从而决定吸附效果。如果流速太快，吸附质分子来不及扩散到树脂内表面就已经从柱中流出而泄漏，造成样品流失，但流速太慢会造成试验周期过长，增加成本。图2为不同流速下样品的泄漏率。从图中可以看出，绿原酸泄漏率随上样流速的加快而升高，上样流速大于4 mL/min时，绿原酸的泄漏率迅速升高。
2.3.2 上样液pH对绿原酸吸附率的影响 图3为上样液pH对动态吸附绿原酸吸附率的影响。可以看出，绿原酸的吸附率随pH的增大呈先上升后下降的趋势，pH为3时吸附率最高。这可能是由于绿原酸作为多羟基酚酸在酸性条件下以分子形式存在，疏水性增强，易被树脂吸附；但在强酸性条件下以内酯形式存在的绿原酸易水解。
2.3.3 梯度洗脱曲线的绘制 分别选用体积分数10%、30%、50%、70%、90%的乙醇作为洗脱剂，绿原酸的洗脱效果有较大差异（图4）。当乙醇体积分数为10%时，洗脱液中绿原酸浓度很低，将此部分洗脱液冷冻干燥，干粉呈淡灰色，在空气中易吸潮，与蒽酮试剂反应呈绿色，与费林试剂反应有红色沉淀产生。这些特点与糖的特性相吻合，因此可以采用10%的乙醇把提取物中糖类化合物分离出来。乙醇体积分数为30%和50%时均出现了洗脱液浓度峰，这可能是因为紫外分光光度计测得的数据为总绿原酸含量，不同浓度洗脱剂的洗脱液中含有不同种类的绿原酸，绿原酸的单体分离工作还有待下一步试验研究。将此部分洗脱液收集起来，旋转蒸发除去乙醇再冷冻干燥后得到绿原酸粗品，紫外分光光度法测得绿原酸纯度为77.4%。
3 结论
运用正交试验得到超声辅助醇提法从平卧菊三七中提取绿原酸的工艺条件为乙醇体积分数70%、料液比1∶15（m∶V，g/mL）、pH 4、超声功率120 W，绿原酸提取率为3.13%。通过静态吸附与解吸试验得到纯化绿原酸的最佳树脂为HPD600型，通过动态解吸试验得到最佳树脂的吸附—解吸条件为上样流速2 mL/min、pH 3，分别用5 BV的去离子水和体积分数10%的乙醇洗脱后依次用5 BV的体积分数30%及50%的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发去乙醇后冷冻干燥，得到的绿原酸纯度为77.4%。
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