平卧菊三七组织培养技术研究
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摘 要：该研究以平卧菊三七的叶片为外植体，对影响其愈伤组织诱导及芽分化的相关因素进行了探讨。结果表明，适合平卧菊三七愈伤组织诱导的最佳培B基为MS+2，4-D 1mg/L；愈伤组织分化出芽的培养基配方为MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.4mg/L。在1/2 MS+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.3mg/L的培养基配方上生根较好，移栽到不同基质中的组培苗，存活率达100%。
关键词：平卧菊三七；组织培养；外植体
中图分类号 S565.4 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）14-0038-03
Abstract：Taking leaf blade of Gynura procumbens（Lour.）Merr as explants material，the factors that influence the callus induction and bud differentiation of Gynura procumbens（Lour.）Merr were studied.The results showed that the initial medium for the callus induction was MS+2，4-D 1 mg/L；the best medium for adventitious was MS+6-BA 1 mg/L+ NAA 0.4mg/L.The best subculture media for shoot proliferation was 1/2 MS+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.3mg/L.Tissue culture seedlings were transplanted to a different matrix，the survival rate was 100%.
Key words：Gynura procumbens（Lour.）Merr；Tissue culture；Explant
平卧菊三七[Gynura procumbens（Lour.）Merr.]为菊科菊三七属多年生宿根草本植物，是新开发出的一种药食兼用的特种经济作物，具有通经活络，止痛消肿，消炎止咳，清热解毒，活血生肌、抗病毒和增强人体免疫力等功效[1]。目前在江西宜春靖安县有大规模种植，并且已建立平卧菊三七苗木繁育科技示范基地3个，面积约13.33hm2。平卧菊三七的繁殖方式主要是种子繁殖和扦插繁殖，而这2种传统的繁殖方法易受到季节的影响，远不能满足市场上大规模的需求，急需找到一种快速繁殖种苗的新方法。植物组织培养是近几十年来发展起来的一项无性繁殖技术，具有繁育周期短、种苗供应量大的特点，并且能很好的保证母本的优良品种特性。国内有部分研究者对平卧菊三七的组织培养技术进行了研究，如宋锡全等[2]以平卧菊三七的茎段为材料，利用诱导丛生不定芽培养基培育形成试管苗，同时还试验了3种培养基对茎段带菌液体培养生根生长的影响；石泰雷等[3]以平卧菊三七幼嫩茎段为材料，在已有分化培养基和生根培养基的基础上，用市售普通白糖替代分析纯蔗糖，并去除部分有机成分对平卧菊三七的快繁体系进行了优化；黄宝祥等[4]以平卧菊三七茎段为外植体，对其进行增殖培养、生根培养和栽培试验，并取得一些结果。但以上这些研究都是以平卧菊三七茎段为材料，没有获得其愈伤组织，其繁殖率远没有达到预期的高效，同时，对平卧菊三七品种后期的改良也不能提供进一步的技术支持。
鉴于此，本研究将选取平卧菊三七叶片为初代培养的外植体，通过脱分化诱导愈伤组织，再分化形成芽苗，从而获得平卧菊三七的组培苗，同时进一步加速平卧菊三七的扩繁周期，提高平卧菊三七继代增殖培养速率与质量，优化平卧菊三七生根条件，为最终建立优质高效的平卧菊三七组培快繁技术体系提供理论与实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料 平卧菊三七采自江西宜春靖安县（北纬28°46′～29°06′，东经114°55′～115°31′），栽植于宜春学院试验基地，剪去当年生枝条上的新叶。
1.2 方法
1.2.1 外植体灭菌 外植体采集时间为晴天上午，取平卧菊三七生长期内健康无病虫害、生长旺盛植株的当年生枝条上的新叶。先用洗洁精水漂洗5～15min，流水冲洗30min左右。后浸泡于无菌水中待用，于超净工作台上将外植体用75%的乙醇消毒处理15～20s，无菌水冲洗3～5次，然后用0.1%的升汞浸泡6～8min，再用无菌水冲洗多次，将叶片置于已灭菌的滤纸上吸干表面的水分后，用解剖刀切成面积大小为1cm2左右的小块。
1.2.2 平卧菊三七丛生芽诱导培养 将生长状况良好的愈伤组织切成小块，接种到丛生芽诱导培养基上，培养基配方为MS培养基添加不同量的6-BA和NAA（见表1），培养约30d后统计丛生芽的出芽率及生长情况。
1.2.3 平卧菊三七组培苗生根培养和炼苗移栽 选取生长良好，长势一致的分化苗接到生根培养基中，平卧菊三七生根培养基以1/2MS为基本培养基，添加不同浓度IBA，培养一段时间后统计其生根率。当组培苗生长到一定高度时，从光照培养箱中取出，打开瓶盖，倒入少量无菌水，置于室内（避免阳光直射），一星期后，洗去根部培养基，晾干植株表面水分，栽植于不同基质中，45d后统计成活率及生长情况。
1.2.4 培养条件 诱导愈伤组织培养条件为暗培养，培养温度为25～28℃；其余阶段培养条件均为光照强度3000lx，光照时间12h，培养温度为25～28℃。
2 结果与分析
2.1 平卧菊三七的愈伤组织诱导 平卧菊三七叶片组织块接种到诱导培养基中，7d后观察到叶片边缘开始卷曲，并看到有黄色、颗粒状愈伤组织产生，20d后统计其出愈率。结果见表1和图1A。由表1可知，不同浓度的2，4-D均可诱导产生愈伤组织，当2，4-D浓度为1mg/L时，愈伤组织诱导率达到最高；继续增加2，4-D的浓度，愈伤组织诱导率反而下降，且随着培养时间的延长，这些愈伤组织较早出现老化现象。因此，适合平卧菊三七愈伤组织诱导培养基为MS+2，4-D1mg/L+0.7%琼脂+2%蔗糖。
2.2 平卧菊三七丛生芽诱导培养 生长状况良好的平卧菊三七愈伤组织在分化培养基中培养30d后，观察不定芽生长情况，结果见表2和图1C和图1D。由表2可知，影响平卧菊三七丛生芽生长的植物生长调节剂主要是细胞分裂素6-BA和生长素NAA的协同作用，在6-BA浓度一定的情况下，当NAA浓度从0.2mg/L增加到0.6mg/L时，平卧菊三七丛生芽的出芽率先增加后减少；但是当NAA浓度为0.4mg/L时，随着6-BA的增加，平卧菊三七丛生芽的出芽率程大幅度变化，最高可达71.3%，最低甚至为0%，没有出芽，说明对于平卧菊三七丛生芽的诱导，激素6-BA和NAA的浓度只要达到合适的范围，才能保证出芽率最高。因此，最适合平卧菊三七愈伤组织分化出芽的培养基配方为MS+6-BA 1mg/L+NAA0.4mg/L+0.7%琼脂+2%蔗糖。当平卧菊三七丛生芽长到4～5cm高时，随即移到增值壮苗培养基中继续生长。20d后，苗会进一步长高长壮，就可以进行下一步的生根培养了。
2.3 平卧菊三七组培苗的生根培养和炼苗移栽 将平卧菊三七幼苗接入生根培养基中约10d左右开始生根，20d后随机挑选3瓶统计平卧菊三七生根情况，结果见表3和图1E及图1F。由表3可知，IBA对平卧菊三七生根有一定的促进作用；当不加IBA时，根系生长缓慢；当IBA浓度从0.1mg/mL增加到0.5mg/mL时，根系生长数量增多，彼此差异变化幅度不大，综合比较，平卧菊三七最适生根培养基为1/2MS+0.5mg/mL IBA+0.2mg/mL NAA。同时，将生长良好的幼苗经过适当炼苗后，移栽至不同基质中，45d后观察平卧菊三七生长状况，结果表明，平卧菊三七组培苗对土壤要求不是特别严格，在各种基质中都可以存活，存活率达100%。
3 结论与讨论
植物离体快速繁殖体系的建立，需要离体的外植体材料在无菌的条件下完成脱分化和再分化，才能培养出组培苗。本研究中，x用叶片作为外植体，当培养基中2，4-D浓度小于1mg/L时，愈伤组织诱导率逐渐增加；当2，4-D浓度高于1mg/L时，愈伤组织诱导率反而下降，并且培养出的愈伤组织质地也较差，颜色较暗。说明2，4-D浓度过高或者过低不利于愈伤组织的诱导。这与一些学者的研究结果是一致的，尽管较高浓度的2，4-D有利于胚性愈伤组织的诱导，但一定程度上2，4-D也是促使愈伤组织褐化的一个因素[5-9]。故对于愈伤组织的诱导2，4-D使用的浓度不宜过大，从而减少培养过程中材料组织的无性系变异。本实验中最适合的愈伤组织诱导培养基配方为MS+2，4-D1mg/L+0.7%琼脂+2%蔗糖。
在植物愈伤组织分化中，6-BA是一种重要的植物生长调节剂，单独使用可以使愈伤组织得以分化[10]。但通常与其他植物生长调节剂配合使用，能起到更好的效果。本研究中，最适合平卧菊三七愈伤组织分化出芽的培养基配方为MS+6-BA1mg/L+NAA0.4mg/L+0.7%琼脂+2%蔗糖，表明平卧菊三七愈伤组织分化出芽过程中，6-BA和NAA的浓度达到合适配比后，能使其出芽率大幅度提高。
综上所述，本研究成功建立了一套完整的平卧菊三七快速繁殖体系，为其工厂化和规模化育苗提供了技术支持。
参考文献
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