几种中药提取物对不同病原菌的抑制作用
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随着时代的发展，人们健康意识的逐渐提高，环境与农产品的安全性受到了广泛重视，而且对农药残留的限制也要求的很严格。近年来，化学农药被大量使用于农业生产中，由于多数在自然环境中不易降解，蓄积能力强，导致污染了环境，使病虫害产生了抗药性，破坏了生态平衡，农作物及畜产品中农药残留量超标，危害了人体健康。而最值得注意的是生产这些化学农药过程中三废的排放问题，按我国1998年生产化学农药约18万t计，年排放的三废超过40万t[1]。因此，化学农药的使用量势必会不断下降，而植物源农药将替代化学农药广泛应用于农业生产中。
植物源农药的活性成分是自然存在的物质，在自然界中的降解不污染环境，不会对人体产生危害，且低毒、低残留、病虫害不易产生抗药性， 农产品的高品质能够得到充分保留。植物源农药活性成分复杂，通常能作用于靶标生物的多个位点，有利于延缓靶标生物的抗药性；有些植物源农药还能刺激植物生长，起到生长调节作用[2]。因此植物源农药在农业生产中具有广阔的应用前景。
纪淑娟等对丁香抑菌成分超声波提取工艺进行研究，得到以95%乙醇为溶剂的提取物对灰葡萄孢菌的抑菌率为62.47%[3]；杨帮等对美洲商陆抑菌活性进行研究，得出以极性强的甲醇为溶剂对柑橘绿霉病和小麦纹枯病2种病原菌的抑菌率均达100%[4]；崔永明等在甘草总黄酮的提取技术及其抑菌活性研究中指出甘草总黄酮对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用均较为明显[5]；杨国平等通过天南星提取物对小鼠S180肉瘤的抑制作用的研究，得出天南星醇提物对小鼠S180肉瘤表现出明显的抑制生长作用，并未造成明显毒害作用[6]。根据上述文献可知，丁香、商陆、甘草、天南星对不同致病菌有很强的抑制生长作用，而为研究不同中药提取物对不同致病菌的抑制作用，本试验选用8种中药材的提取物对4种主要致病菌进行抑菌活性研究，以筛选出χ饕致病菌有抑制作用的中药提取物，对于开发和利用我国丰富的中药植物资源，有着十分重要的意义。
1 试验材料
1.1 试验仪器与试剂
LRH―280型微电脑控制生化培养箱、LDEX―40SCⅠ型立式自动电热压力蒸汽灭菌器、无菌操作台、高压蒸汽灭菌锅、回流提取器、HH―S型恒温水浴锅、培养皿、试管、分析天平p托盘天平p玻璃棒p烧杯、量筒、锥形瓶、玻璃吸管p酒精灯p涂布棒、打孔器、接菌环、挑针、记号笔等。95%乙醇、75%乙醇、无菌水等。
1.2 供试菌种
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli），由吉林农业科技学院微生物实验室提供；带有薏苡弯孢叶斑病菌的病叶和菜豆灰霉病菌的病果，均采自吉林农业科技学院九站校区药植园。
1.3 供试药材
辛夷（Magnolia biondii Pamp.）的干燥花蕾、艾蒿（Artemisia argyi Levl.et Van.）的干燥叶、北豆根（Menispermum dahuricmn DC.）的干燥根茎、天南星[Arisaema erubescens （Wall.） Schott]的干燥块茎、丁香（Eugenia aromatica Baill）的干燥花蕾、商陆（Phytolacca acinosa Roxb.）的干燥根、甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的干燥根和根茎、萝[Metaplexis japonica （Thunb.） Mark.]的干燥全草，以上药材均购自国营中药材药店。
1.4 培养基
PDA培养基：土豆 200g，葡萄糖 20g，琼脂 20g，水 1000ml；高温湿热灭菌：121℃ 30min。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl 5g，琼脂 20g，水 1000ml；pH 7.0-7.2；高温湿热灭菌：121℃ 30min。
2 试验方法
2.1 病原菌的分离、纯化与鉴定
2.1.1 薏苡弯孢叶斑病菌的分离、纯化与鉴定
取带有病斑的薏苡叶，于病健交界处剪成2mm×5mm的长方形小块，在无菌操作台中对其进行表面消毒，先置于75%乙醇中灭菌25s，取出，然后放入到0.1%升汞中灭菌3-5min，取出，再放入到无菌水中洗涤3次。
将上述经灭菌的病组织采用五点法接种于PDA培养基上培养，倒置于28℃的恒温箱中培养3-5d，观察菌体生长情况，挑取组织边缘长出的菌丝，接种到新培养基中，多次重复挑取、接种，进行纯化。
根据左淑珍等对玉米弯孢菌叶斑病及其抗源鉴定、抗性遗传研究现状鉴定此种病菌为薏苡弯孢叶斑病菌（Coix curvularia lunata）[7]。
2.1.2 菜豆灰霉病菌的分离、纯化与鉴定
菜豆灰霉病菌的分离采用菌丝直接挑取培养法。将带病的病果用无菌水擦洗干净，在无菌操作台上，用75%乙醇擦拭没有菌丝的部分进行表面消毒，用消毒过的镊子拨开表层菌丝，挑取内层的菌丝，将其接种于PDA平板培养基上，倒置于28℃恒温箱中培养，3天后观察、挑取边缘菌丝，将其移至新培养基上培养，进行纯化。
根据杨素梅等对菜豆灰霉病的发生与防治措施的研究鉴定该病菌的病原菌为灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）[8]。
2.2 中药提取液的制备
将上述中药材料粉碎，取粉碎的各类药粉30g，以95%乙醇为溶剂（药粉：95%乙醇=1：15[3]），采用回流提取法提取4h（提取温度为85℃），然后将提取液置于旋转蒸发仪中进行浓缩，再用95%乙醇定容，使溶液的浓度为1g/ml，然后移置广口瓶中，密封， 保存于4℃冰箱中，备用。
2.3 供试菌种的活化扩繁与菌悬液的制备
薏苡弯孢叶斑病菌、菜豆灰霉病菌的活化扩繁：将冰箱中纯化的病原菌取出，在无菌操作台中分别用灭菌后的接种环接种于新PDA培养基上，在28℃恒温箱中培养3-5d，备用。
金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的活化：分别将菌种用接种环接种于含牛肉膏蛋白胨培养基试管中，37℃恒温培养24h，备用。
菌悬液的制备：将20ml无菌水倒入含已活化好的细菌的试管中，用灭菌的接种环将菌种挑起，稍加振摇，既得金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的菌悬液。
2.4.1 几种中药提取物对病原真菌的抑制作用
采用生长速率法[9]，测定各类药材1g/ml的乙醇提取物对供试菌种的抑制效果。
在无菌条件下，取各类药材提取物1ml分别加入无菌的直径9cm培养皿中，对照组加入等量95%乙醇，再加入10mlPDA培养基，混匀，待其凝固后，得到含药平板。用直径0.6cm的打孔器分别制得薏苡弯孢叶斑病菌和菜豆灰霉病菌的菌饼，用挑针将菌饼接种于含药平板中央，28℃条件下进行恒温培养，每次处理重复3次。3d后开始观察菌落大小，并采用十字交叉法测量菌落直径，连续测量4d，并记录数据，计算抑菌率[9]。
菌落生长抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-打孔器直径）×100%
所得结果通过spss软件进行方差分析，进而采用SNK-q检验法进行显著性检验。
2.4.2 几种中药提取物对细菌的抑制作用
采用滤纸片法[10]，测定各类药材1g/ml的乙醇提取物对供试菌种的抑制效果。
用打孔器将滤纸打成直径0.8cm的圆片，经高压蒸汽灭菌后，放入盛有各提取物的容器中浸泡1h，对照组滤纸片用95%乙醇浸泡。向平板中的培养基表面加入0.5ml已配制的金S色葡萄球菌及大肠杆菌的菌悬液，用三角涂布棒将其均匀涂布，采用五点法将浸泡好的滤纸片放入到平板中，每次处理重复3次，于37℃条件下恒温培养24h，然后用十字交叉法测量抑菌圈直径。用表示抑菌圈的直径。
2.5 几种中药提取物的最小抑菌浓度测定
通过上述实验，筛选出丁香和辛夷对两种病原真菌、商陆对菜豆灰霉病菌分别作最小抑菌浓度试验。在无菌条件下，用95%乙醇将各提取物稀释成稀释度为1/2、1/4、1/8、1/16、1/32的溶液，分别精取各浓度溶液1ml与适量PDA培养基混合均匀，制成含药培养基，冷却，备用。将打好的病原菌菌饼接种到含药培养基上，倒置于28℃恒温箱中培养，每次处理重复3次，从第3d开始观察，每间隔1d观察一次，连续观察至第7d。得到最小抑菌浓度[9]。
3 结果与分析
3.1 几种中药提取物对真菌的抑制作用
3.1.1 几种中药提取物对菜豆灰霉病菌的抑制作用
由表3-1可知各类中药提取物除天南星外都对病原菌的生长产生了抑制作用，其中辛夷、商陆和丁香的提取物对菜豆灰霉病菌的抑菌率均达100%，与其他中药提取物有极显著性差异；其次是北豆根和萝的提取物，抑菌率达到76.3%；甘草提取物的抑菌率为69.7%；艾蒿提取物的抑菌率相对较低，为33.8%；天南星提取物对菜豆灰霉病菌无抑制作用。从结果来看，辛夷、商陆和丁香的提取物表现出较强的抑菌活性，可见，辛夷、商陆和丁香提取物中含有的抑菌活性成分较多。
3.1.2 几种中药提取物对薏苡弯孢叶斑病菌的抑制作用
由表3-2可知各类中药提取物都对病原菌的生长产生了抑制作用，其中辛夷和丁香的提取物对薏苡弯孢叶斑病菌的抑制效果最好，抑菌率达到100%；其次是甘草和商陆的提取物，抑菌率也达到83%左右；而北豆根、萝和艾蒿提取物的抑菌率也分别达到了70.8%、65.4%、59.1%；天南星提取物对薏苡弯孢叶斑病菌的抑制作用不是很明显，抑菌率为2.5%。从结果看，辛夷和丁香的提取物中抑菌成分的活性较强，可见，辛夷和丁香中的抑菌活性成分为醇溶性成分。
3.2 几种中药提取物对细菌的抑制作用
由表3-3可知，几种中药提取物对大肠杆菌的抑制效果整体比对金黄色葡萄球菌的抑制效果好，其中丁香提取物的活性最强，甘草、商陆和萝的提取物的活性较弱；而这些提取物对金黄色葡萄球菌也有不同程度的抑制效果，甘草和丁香提取物的活性最强，而辛夷和艾蒿提取物对金黄色葡萄球菌均表现为无活性。从结果看，丁香提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有很强的抑制作用；而甘草提取物只对金黄色葡萄球菌表现出很强的活性。
3.3 几种中药提取物的最小抑菌浓度
由表3-4可以看出，不同稀释度的辛夷提取物对真菌的抑制效果不同，浓度越大，抑制效果越好。实验得出，辛夷提取物对菜豆灰霉病菌和薏苡弯孢叶斑病菌的最小抑菌浓度分别为0.125g/ml、1g/ml。
由表3-5可以看出，不同稀释度的丁香提取物对菜豆灰霉病菌和薏苡弯孢叶斑病菌的抑制效果基本相同，最小抑菌浓度均为0.0625g/ml。
由表3-6可以看出，不同稀释度的商陆提取物对菜豆灰霉病菌的抑制效果也是随着浓度的降低而减弱。实验得出，商陆提取物对菜豆灰霉病菌的最小抑菌浓度为0.5g/ml。
综上所述，8种中药提取物除天南星提取物外对两种病原菌均有很好的抑制效果。辛夷、商陆和丁香的提取物对菜豆灰霉病菌抑菌效果最好，达到了完全抑制的效果；辛夷和丁香提取物对薏苡弯孢叶斑病菌抑菌效果也是最好，达到完全抑制的效果。对于细菌来说，这几种中药提取物除辛夷和艾蒿提取物对金黄色葡萄球菌没有抑菌活性外，其他提取物对两种细菌均有不同程度的抑菌活性。总体上来说，这些提取物对大肠杆菌的抑菌活性要好于对金黄色葡萄球菌的抑菌活性，甘草和丁香的提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最强，丁香提取物对大肠杆菌的抑菌活性也最强，其他提取物对大肠杆菌也均有不同程度的抑菌活性。
综合上述实验结果可以看出，丁香提取物对4种病原菌均有很强的抑制作用。丁香提取物的主要成分为挥发油，挥发油中含量最高的组分是丁香酚，而挥发油对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有明显的抑菌作用，丁香酚对不同病原真菌均有较强的抑制和杀灭作用，因此，丁香提取物中主要的抑菌成分应为挥发油中的丁香酚；丁香提取物中抑菌成分并非单一的丁香酚，丁香提取物中所含的脂溶性成分、水溶性成分均对金黄色葡萄球菌有很强的抑菌作用[11]。这与前人研究的丁香提取物对不同致病菌均有很强的抑菌作用相吻合。李巧如等[12]通过研究丁香提取物与各类抗菌素间的相互作用探讨其抗菌机理，推测丁香提取物的抗菌机理可能是由于氨基糖苷类竞争性地抑制蛋白质的合成而产生的。
辛夷提取物对两种病原真菌均有很强的抑菌作用。辛夷提取物中生物碱类成分对致病性的真菌有明显的抑制作用；高浓度的辛夷提取物对细菌有不同程度的抑制作用[13，14]。商陆提取物对菜豆灰霉病菌有很好的抑制作用。商陆提取物中的总皂甙成分对真菌菌体的生长有很好的抑制作用[4]。甘草提取物中主要含有甘草酸、甘草苷、异甘草素等活性成分，对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌活性[15]；甘草中的总黄酮成分对细菌的抑菌效果也较为明显[5]。
本试验分别用8种不同中药的乙醇提取物对4种常见致病菌作了抑菌活性研究，从结果来看，总体上这些提取物的抑菌效果有明显差异，但个别提取物之间的差异不明显，产生这样的原因可能是由于提取过程中的差异造成，或是其他成分同时也被提取出来，也有可能是药材地域性、季节性的变化而影响其有效成分含量，亦或是致病菌本身的差，而影响了对各个菌种的抑菌效果。本试验只采用了95%乙醇作为提取溶剂提取得到8种中药的粗提物，没有对其他溶剂进行研究，也没有对粗提物进一步提取确定其抑菌活性成分为单体成分或几种成分联合作用进行研究；真菌在恒温培养箱培养条件下不能产生分生孢子，因而只对菌丝作了抑菌活性研究，没能作对致病菌分生孢子形成和萌发的影响试验[9]，导致了本试验的局限性。另外，试验中只针对室内的抑菌活性进行了研究，其在田间试验的防治效果如何，对筛选出抑菌活性强的提取物制成何种剂型能被植物有效吸收，使用后是否能完全降解，还需作进一步深入研究。本研究初步筛选出丁香提取物对不同致病菌均有明显的抑制作用，为后续开发植物源农药应用于生物防治中提供了理论依据。