一测多评法测定药材丹参中4种丹参酮类成分的含量

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摘要：目的：采用一测多评法测定丹参4种酮类成分含量。方法：使用HPLC，对照品选取丹参酮ⅡA，用外标法测定其含量。测得丹参酮ⅡA和丹参酮Ⅰ 、二氢丹参酮、隐丹参酮之间的相对校正因子。计算获得其余成分的含量，达到一测多评。结果：4种丹参酮类成分的含量与相对校正因子计算的结果无明显差异，相对校正因子的重现性均较好。结论：采用一测多评法对药材丹参中的4种丹参酮类成分的含量进行测定具有较好的适用性。

主题词：一测多评法；丹参；相对校正因子；酮类成分含量

一测多评法最早由王智民等提出 [1]，通过仅对一种已获取的成分测定，作为对照品，并同时实现多组分同步检测。目前实际可行的包括有三七、人参、关黄柏等中药药材可以使用一测多评法进行检测[2]。丹参由于各种因素的影响，其主要成分会有较大的差异[3]。本文旨在采用一测多评法测定药材丹参中4种丹参酮类成分的含量，现汇报如下。

1 仪器与试药：

采用美国Waters公司生产的Waters2695型HPLC仪，美国戴安公司生产的Dionex UltiMate3000型HPLC仪。色谱柱：采用上海欧尼科技生产的Shim-pack PREP-ODS（H）KITC18（250mm×4.6mm，5μm，S），以及杭州汉泽仪器生产的Welch Material C18（250mm×4.6mm，5μm，W），以及美国Waters公司生产的Waters SunFire C18（4.6mm×250mm，5μm）。

混合对照品购买情况：二氢丹参酮Ⅰ（成都曼斯特生物科技有限公司，批号A0060）、丹参酮ⅡA（批号110766-200619）、丹参酮Ⅰ（ 批号0867-200205）、隐丹参酮（批号110852-200305）均购于中国药品生物制品检定所，均由中国食品药品检定研究院鉴定，纯度>98%。乙腈为山东禹王生产的色谱纯，水超纯水。其他试剂均为分析纯。

供试药品：药材丹参（产地：山东沂南），6份不同批号药材。

2 方法与结果：

2.1 色谱条件：

色谱柱：Shim-pack PREP-ODS（H）KITC18（250mm×4.6mm，5μm，S），流动相：乙腈-0.2%乙酸（55：45）。柱温30℃，流量：1.0ml/min，在270nm检测。混合对照品的色谱图见图1，丹参样品的色谱图见图2。

2.2 混合对照品溶液的制备：

分别取适量的对照品进行精密的称量（丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、二氢丹参酮）。加入甲醇进行溶解，并配成以下规格的混合对照品溶液：丹参酮ⅡA（30μg/ml）、丹参酮Ⅰ（40μg/ml）、隐丹参酮（30μg/ml）、二氢丹参酮（5μg/ml）。

2.3 供试品溶液的制备：

取丹参药材粉碎研磨成细粉状，经三号筛筛选。精密称取约0.3g，置于具塞棕色瓶中，精密加入50ml的甲醇，注意密封。称定重量后进行超声处理40min（功率为250W，频率为33kHz）。冷却后再进行称量，以甲醇补足减轻的重量。最后摇匀，滤过，取续滤液。

2.4 线性关系考察：

取混合对照品溶液，并按照1：1，1：4，1：8，1：12，1：16，1：20的分别稀释，配成不同质量浓度的对照品溶液。分别进样10μL。采用峰面积积分值进行线性回归，结果见表1。可见，各对照品的进样量与峰面积值得线性均良好。

2.5 精密度试验：

日内精密度：用对照品溶液连续进样5次（每3h进行1次），计算得出二氢丹参酮Ⅰ，隐丹参酮，丹参酮Ⅰ，丹参酮ⅡA的峰面积积分值RSD分别为1.13%，0.53%，0.49%与0.32%，均符合要求。

日间精密度：用对照品溶液连续进样3d（每天3次），计算得出二氢丹参酮Ⅰ，隐丹参酮，丹参酮Ⅰ，丹参酮ⅡA的峰面积积分值RSD分别为1.24%，0.32%，0.29%与0.64%，均符合要求。

2.6 重复性与稳定性试验：

2.6.1 重复性试验：

取同一份样品6份，并按照“2.3”平行制备溶液，并进样测定。得到二氢丹参酮Ⅰ，隐丹参酮，丹参酮Ⅰ，丹参酮ⅡA含量的RSD分别为0.82%，0.56%，0.19%与0.52%，证实该法的重复性较好。

2.6.2 稳定性试验：

取上述重复性试验的同一供试品分别于0，3，6，9，12，24，48h进行连续进样，并记录下48h内的峰面积，计算得到二氢丹参酮Ⅰ，隐丹参酮，丹参酮Ⅰ，丹参酮ⅡA的峰面积积分值RSD分别为0.53%，0.37%，0.65%与0.33%，可见稳定性较好。

2.7 加样回收率试验：

取6份供试品。按照各成分的不同质量分数加入适量对照品，制备成供试品溶液。测定并计算对照品的回收率。得到二氢丹参酮Ⅰ，隐丹参酮，丹参酮Ⅰ，丹参酮ⅡA的平均回收率分别为99.7%，98.8%，96.9%与99.4%，RSD依次为1.3%，0.91%，1.32%与1.71%。

2.8 相对校正因子的计算：

取“2.4”中配置的混合对照品溶液，各进样10μL，以丹参酮ⅡA为内标，分别计算其余3种成分的相对校正因子。详见表2。

2.9 样品测定：

取6份不同批号药材制成的供试品溶液进行测定。分别使用外标法与一测多评法对供试品的4种成分的含量进行计算，结果见表3。可见两种方法测定的结果并无显著的差异。

3 讨论：

有文献指出，二氢丹参酮Ⅰ，隐丹参酮，丹参酮Ⅰ，丹参酮ⅡA均为中药丹参中的主要成分，并可通过HPLC的测定得到分离与证实[4]。而近几年开展的“一测多评法”具有较高的应用价值，已在众多其他中药成分分析中得到广泛的采纳。本文就在中药丹参的成分测定中进行了一系列综合的方法学评价试验加以验证。

本次实验中，采用了HPLC对6份不同批号的丹参药材进行外标法的测定丹参酮ⅡA，并测定与计算了丹参酮ⅡA与其余3种成分的相对校正因子。以各相对校正因子计算了其余3种成分的含量，实现了一测多评。此外，同时也将各结果与外标法结果进行比较，并无显著的差异。结果提示采用相对校正因子进行计算的结果与外标法的无显著差异，可见一测多评法的适用性与可行性，能够可靠地运用在中药丹参的酮类成分的含量测定中。

综上所述，采用一测多评法对中药丹参中的4种丹参酮类成分的含量进行测定具有较好的适用性，值得推广采纳与应用。

参考文献：

[1]肖晶，高尚伟，杨大进，等.HPLC法测定保健食品中丹参酮类成分的含量[J].卫生研究，2009，38（4）：493-494.

[2]李贝宁，周晓丽，黄璐琦，等. 不同产地丹参功能基因表达水平对丹参酮类成分积累的影响，中国中药杂志，2011，36（24）：3406-3407.

[3]刘劼，杨黄浩，黎先春，等. HPLC-电喷雾飞行时间质谱分析丹参中的丹参酮类化合物[J]，质谱学报，2009，29（5）：261-262.

[4]蓝天凤，王晓，王岱杰，等. 一测多评法测定丹参中4种丹参酮类成分[J].中草药杂志，2012，43（12）：2420-2421.