芍药籽中几种单萜苷含量的测定

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（信阳农林学院生物技术系，河南 信阳 464300）

摘 要：建立了RP-HPLC法测定芍药籽中单萜苷类含量的方法。芍药苷等单萜苷类物质具有较好的生物活性，目前，芍药中的单萜苷目前主要来源于芍药的根，分析结果表明，芍药籽仁中也含有较多的单萜苷，这些单萜苷也可以作为另一个重要的单萜苷来源。

关键词：RP-HPLC法;单萜苷;含量测定

0 引言

芍药属毛茛科，双子叶植物纲，为灌木或多年生草本植物。芍药是多年生宿根草本，具纺锤形肉质根。芍药苷是芍药中提取的主要活性成分，具有解痉镇痛和改善记忆、抗自由基损伤等功能和抑制细胞内钙超载、抗KA神经病变的生理功能。

单萜苷类化合物是天然药物中一类重要的化学成分，在植物中广泛分布，是许多常用中药的有效成分，如芍药、牡丹、花椒等。主要有无环、单环、双环、三环单萜苷和环烯醚萜苷等多种结构类型。

1 材料与方法

1.1 实验原料

芍药（Paeonia lactiflora Pall.）籽：采自河南省孟津县土桥村花木公司基地，原植物及样品由该公司总经理卫志鹏老师鉴定。

1.2 实验仪器与试剂：

仪器： Agilent1100高效液相色谱仪（安捷伦公司）;SENCO W201恒温水浴锅（上海申生科技有限公司）; FA2004电子天平（天津市天分分析仪器厂） ;YXJ-A高速大容量电动离心机（江苏金坛市环宇科学仪器厂）; SB-2A型紫外分光光度计（天津市天分分析仪器厂）;100 mL容量瓶、1 mL/5 mL移液管、50 mL/100 mL量筒、40 mL/50 mL/80 mL烧杯、100 mL圆底烧瓶等玻璃仪器均来自四川蜀牛玻璃仪器厂;0-100酒精计（河北省武强县同辉仪表厂）;试剂：磷酸，分析纯;乙腈，色谱纯;甲醇，色谱纯;磷酸二氢钾，色谱纯;二次蒸馏水，自制;对照品：4′′-羟基白芍苷，氧化芍药苷，白芍苷，芍药苷，paeonidanin和白芍苷R1等均为本实验室自制，经NMR和 ESI-MS鉴定了化合物的结构，经HPLC测定纯度大于98%。

2 实验条件

2.1 色谱条件

Agilent1100高效液相色谱仪;色谱柱：Zorbax SB-Aq C18色谱柱（4.6×250 mm，5?m）;流动相：乙腈-磷酸（0.05），或乙腈-磷酸二氢钾缓冲盐（pH=3.0）;体积流量为1.0 mL・ min-1;柱温：30℃;进样量：10 μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取对照品4′′-羟基白芍苷10.3 mg，氧化芍药苷10.4 mg，白芍苷10.8 mg，芍药苷18.6 mg，paeonidanin 14.9 mg，白芍苷R1 8.1 mg，用甲醇定容于50 mL容量瓶中，配成浓度为206 μg・mL-1， 208 μg・mL-1， 216 μg・mL-1， 372 μg・mL-1， 298 μg・mL-1， 161 μg・mL-1的混合溶液，即为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取采集的芍药种子，脱壳机脱壳，收集芍药籽仁和籽壳，将籽仁和籽壳置于100℃的烘箱中烘3h。将经过烘干的芍药籽壳和籽饼粕粉碎，过60目筛，分别精密称取10.00克样品，用滤纸包好，加入100mL甲醇为提取溶剂，采用索氏提取器回流提取4h。回收提取液，冷却后，滤液用0.45?m的微孔滤膜过滤，定容于100mL容量瓶中，即为供试品溶液。

3 实验结果

3.1 吸收紫外波长的选择

采用紫外可见分光光度计对制备的6个单萜苷标样溶液在波长200～400 nm间扫描进行全波长扫描。可以看出4′′-羟基白芍苷和氧化芍药苷在260 nm处有明显的吸收峰，白芍苷，芍药苷，paeonidanin和白芍苷R1在232 nm处有最大吸收峰。因此，本测定方法的吸收波长采用变波长法测定，根据保留时间，测定4′′-羟基白芍苷和氧化芍药苷时选择260 nm波长，测试白芍苷，芍药苷，paeonidanin和白芍苷R1等时选择测定波长为232 nm。所以HPLC的检测波长为（0～7.5 min） 260 nm， （7.5～22 min） 232 nm。

3.2 洗脱流动相的选择

由于单萜苷类化合物含有较多的羟基，这些羟基与固定相作用较强，会导致拖尾。所以文献报道分离芍药苷等单萜苷类的流动相多为乙腈-磷酸水体系[1-3]。本文优化了乙腈-磷酸水体系作为分离流动相的分离效果。发现仅仅乙腈-磷酸水体系难以实现对4′′-羟基白芍苷和氧化芍药苷两种单萜苷的分离。我们参考苷类分离方法的文献[4]报道，对乙腈-磷酸二氢钾缓冲盐体系对单萜苷类的分离体系进行了优化，最终选择乙腈-磷酸二氢钾缓冲盐（pH=3.0）为本实验的流动相。分离洗脱条件为：梯度洗脱，梯度为0 min（A， 15%）10min（A， 15%）22min（A， 25%）。在此条件下，各个单萜苷都得到很好的分离，并且分析时间较短。

3.3 供试品的制备方法的选择

本实验比较了甲醇、乙醇和乙腈等溶剂提取单萜苷的效率，同时对不同的提取方法（超声、索氏回流、冷浸，回流）、提取时间、料液比及溶剂浓度进行了优化，以其中主要成分芍药苷的含量作为衡量标准。结果发现采用10倍量的甲醇和乙腈用索氏提取器回流4h时芍药苷的得率比较接近，大于用其它提取方法得到的得率。但乙腈毒性较大，综合评价得率和安全性等因素，最后选择甲醇作为提取溶剂。

3.4 线性关系考察

精密吸取混合对照品储备液1 mL加入到10 mL容量瓶中，用甲醇定容。然后吸取0.75 ?L、1.5 ?L、3 ?L、6 ?L、12 ?L注入色谱仪，按照2.1项下的色谱条件进行测定，记录峰面积。以对照品的峰面积（Y）为纵坐标，进样量（X）为横坐标进行线性回归，得4′′-羟基白芍苷，氧化芍药苷，白芍苷，芍药苷，paeonidanin和白芍苷R1的线性回归方程见表1。

3.5 样品含量的测定

将经过烘干的芍药籽仁和籽壳用高速粉碎机粉碎，过60目筛。按照“1.6”项下的方法制备供试品溶液。精密吸取对照品混合物和供试品溶液各10?L，注入高效液相色谱仪，照上述色谱条件分别测定，外标法计算不同部位中各个组分的含量，结果见表2。

4 试验结论

建立了RP-HPLC法测定芍药籽中单萜苷类含量的方法，分析结果表明，芍药籽中的单萜苷类成分具有较好的生物活性，其在芍药籽壳中含量相对较少，主要存在于芍药籽仁中。以后芍药籽仁可以作为除了芍药的根以外的另一个重要的单萜苷来源。

另外，分析测试结果发现，在芍药籽饼粕中还有其它的一些单萜苷类化合物存在，这些物质目前并没有被分离得到，进一步研究这些化合物的结构对于芍药籽饼粕深入研究开发具有重要意义。

参考文献：

[1]李伟铭，赵月然，杨燕云. HPLC波长切换法同时测定白芍饮品中9种成分的含量[J].药物分析杂志，2011，31（12）：2208-2212.

[2]刘普，李亮，邓瑞雪. 凤丹籽饼粕单萜苷类成分的研究[J].中国药学杂志，2013，48（17）：1445-1448.

作者简介：罗婧（1983-），女，硕士，讲师，研究方向：食品油脂化学。