生物荧光法检测结核分枝杆菌ATP含量

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科研项目 河南医学科技攻关项目,项目编号:2006149

摘 要 目的:建立生物荧光技术检测结核分枝杆菌ATP含量的方法并观察几种抗结核药物异烟肼和利福平的作用。方法:结核分枝杆菌标准株H37Rv的菌悬液,经高温裂解,提取ATP,用生物荧光技术检测ATP含量。条件稳定后,观察菌数和ATP浓度的关系,以及加入不同浓度的抗结核药物后1周之内ATP的动态变化。结果:菌液加入裂解液后100℃煮沸8分钟,迅速降至室温,加入荧光素酶,3～5分钟时测荧光值。按上述步骤提取和测定时菌数和ATP浓度成正比关系。含药液体培养情况:随药物浓度增加,ATP量下降,培养至第7天时,药物的敏感性可以初步进行判断。结论:所建立的生物荧光法检测结核分枝杆菌atp含量,具有简便、快速、敏感、可重复性强等特点,有望成为结核菌体外药敏试验的一种有用的方法。

关键词 结核菌 三磷酸腺苷 生物发光法 药物敏感性试验

doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2010.22.208

耐多药结核和广泛耐药结核的传播是我国结核病控制中的一大难题[1]。由于结核菌生长缓慢,常规药敏试验耗时长,需2～3个月,影响了耐药结核病的早期诊断和合理治疗方案的制定[2],因此很有必要探索一些快速药敏试验的方法。ATP是活细胞内的一种特殊的能量载体,国际上通常用ATP的检测来判断活的微生物水平。本研究即是以生物荧光法检测结核分枝杆菌ATP含量并观察抗结核药物的影响,为进一步药敏试验的建立奠定基础。

资料与方法

菌株情况:本院检验科冻存的结核分枝杆菌标准菌株H37Rv(ATCC25618),先在改良罗氏培养基上37℃培养3周,菌块研磨后置液体培养基Middlebrook 7H9内混悬,调整到麦氏浊度0.5～1.5后,于37℃培养5天时使用。

试剂与仪器:荧光检测仪(Hygiena International公司产品,Pi-102型),裂解液,荧光素酶为其配套产品。

ATP测定方法:菌液50ul,加入50ul裂解液,100℃水浴煮沸8分钟后,迅速降至室温,转移入专用测试管中,加入100ul荧光素酶,混匀,3～5分钟时测试荧光值(relative light units,RLU)。

ATP药敏试验法初步探索:同样浓度的菌液分成若干份,各50ul,分别加入异烟肼(INH)、利福平(RFP),每种药物各设3种浓度和空白对照,INH(0,0.01,0.1,1.0ug/ml),RFP(0,0.01,0.1,1.0ug/ml)。37℃培养0,1,3,5,7天时分别用上述方法测定ATP值。