盐度对仿刺参蛋白摄入量及蛋白酶活性的影响

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摘要：为研究盐度对仿刺参（Apostichopus japonicus）蛋白摄入量及蛋白酶活性的影响，通过考马斯亮蓝G250染色法间接测定仿刺参蛋白摄入量，福林-酚法测定仿刺参消化道蛋白酶活力。结果表明，在盐度为3.1%时，仿刺参蛋白摄入量最多，消化道蛋白酶活力最强；在盐度2.5%～3.1%范围内，随着盐度的升高，仿刺参蛋白摄入量和消化道蛋白酶活力逐渐升高；在3.1%～3.4%范围内，随着盐度升高，仿刺参蛋白摄入量和消化道酶活力均下降。盐度对仿刺参蛋白摄入量及蛋白酶活性的影响明显。

关键词：仿刺参（Apostichopus japonicus）；盐度；蛋白质；蛋白酶

中图分类号：S968.9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）06-1096-03

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.06.026

Abstract：In order to study on effects of salinity on protein intake and protease activity of Apostichopus japonicus，the intake proteins and the activities of protease were determined by Xylene brilliant cyanin G250 method and Folin-phenol method. The results showed that salinity had significant effects on the intake proteins and the activities of protease. The optimum salinity of the protein and protease was 31. More or less 31 caused the decline of the intake proteins and the activities of protease.

Key words：Apostichopus japonicus； salinity； protein； protease

仿刺（Apostichopus japonicus）隶属于棘皮动物门（Echinopermata）海参纲（Holothuriodea）J手目（Aspidochirotida）仿刺参科（Stichopodidae）仿刺参属（Apostichopus），是中国近年来大力发展的海珍品之一。仿刺参为温带种类，主要分布于西北太平洋沿岸，北起俄罗斯的海参崴，经日本海、朝鲜半岛南部到中国黄海、渤海沿岸[1]。仿刺参成分分析可知，每百克生鲜仿刺参含蛋白质21.50 g、脂肪0.30 g、碳水化合物1.00 g、钙118 mg、铁1.40 mg，内脏中含有丰富的粗蛋白、粗脂肪、酸性粘多糖，营养价值与药用价值极高。

20世纪90年代初，疾病爆发使对虾养殖业遭受重创，位于潮间带的养虾池塘被改造用于养殖刺参[2]，池塘养参具有较大的经济价值与生态效益。养参池塘位于潮间带，盐度变化范围较大，而盐度变化必然会对刺参的生长发育带来一系列的影响。盐度对刺参生长方面的研究主要侧重于对呼吸和排泄的影响[1]；盐度因子对刺参生长及行为的影响[3]；盐度对刺参特定生长率（SGR）的影响[4]；盐度骤降对幼仿刺参生长、免疫指标及呼吸树组织结构的影响[5]等方面。

随着海参养殖规模的扩大，了解仿刺参的营养学和消化生理学等内在因素成为健康养殖的关键环节，本试验采用生物化学手段，分析了盐度对仿刺参蛋白摄入量及蛋白酶活性的影响，以期为进一步探究仿刺参内在生理特性与环境因子的关系提供依据，为仿刺参的养殖、饵料配比提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用仿刺参购于威海经济技术开发区金鑫生物科技有限公司养殖场，选购长4 cm，体重5 g左右，伸展自如，疣刺坚挺，体表无损伤，对外刺激反应迅速的幼参作为试验材料。置于自动水循环系统的培养缸中培养7 d，海水盐度2.8%，pH为8.0，水温20 ℃；提供少量饵料，摄食期间停止增氧机，保持良好水质。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂 考马斯亮蓝G250，福林试剂，0.1 mg/mL牛血清蛋白BSA，0.5%的酪蛋白溶液，磷酸盐缓冲液（pH 7.2），10%三氯醋酸，0.4 mol/mL的碳酸钠溶液，酪氨酸标准溶液等。

1.2.2 仪器 紫外分光光度计、台式高速冷冻离心机、恒温水浴锅、烘箱、冷冻柜等。

1.3 试验方法

1.3.1 梯度设置 分别设置2.2%、2.5%、2.8%、3.1%、3.4% 5个盐度梯度，用海盐和曝气自来水进行调节。海参样品运回实验室后，在盐度为2.8%的海水中暂养；用进行不同盐度的驯化，定时巡池，观看仿刺参的摄食及生活状态。

1.3.2 样品制备

1）残饵收集。进入试验阶段后，每天16：30投喂海参重量2%的饵料（饵料∶干海泥=1∶5），并于第二天9：00用虹吸法清除池内粪便和残饵作为样品，带回实验室，用烘箱烘干，备用。

2）粗酶液制备。取新鲜的海参解剖取出消化道，用冷却去离子水洗净后，按1 g肠道加入1 mL的磷酸缓冲液（pH 7.5），将匀浆液在4 ℃下10 000 r/min离心30 min，取上清液，冷冻柜中储存备用。

1.3.3 测定方法

1）考马斯亮蓝法测定蛋白摄入量。仿刺参蛋白摄入量=投喂蛋白量-残饵及粪便蛋白量。考马斯亮蓝法测定饵料和样品（残饵粪便）蛋白含量，用1.0 mg/mL的标准蛋白质溶液给各试管分别加入0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL，然后用去离子水补至0.1 mL，各试管中再分别加入5.0 mL考马斯亮蓝G250试剂。稍加摇动，混合均匀2 min后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595 nm处的吸光度，空白对照试管，即0.1 mL H2O加5.0 mL G250试剂。饵料及收集样品烘干后用磷酸缓冲液（pH 7.2）进行溶解，离心后取1 mL上清液按上述方法并从标准曲线上查得蛋白含量。以标准蛋白质量（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标，即得到标准曲线。根据测出的未知样品的吸光度，可查出未知样品的蛋白质含量[6]，并利用表观消化率分析盐度对仿刺参蛋白摄入量的影响，表观消化率=（投喂总蛋白含量-残饵和粪便蛋白量）/投喂蛋白总量×100%。

2）福林-酚试剂法测定仿刺参消化道蛋白酶活力。向试管中加入0.5%的酪蛋白溶液2.0 mL和磷酸盐缓冲液（pH 7.2） 4.0 mL，在40 ℃下保温5 min，然后加入粗酶提液1.0 mL，保温20 min，立即加入10%三氯醋酸2.0 mL终止反应。取出3 000 r/min心10 min后的上清滤液1 mL，加入0.4 mol/L的碳酸钠溶液5.0 mL，再加入1.0 mol/L的福林试剂1.0 mL，于40 ℃恒温水浴中显色20 min，在分光光度计680 nm波长下比色测定，以蒸馏水校零作为参照，对照管在加入粗酶提液前先加入2.0 mL 10%的三氯醋酸使酶失活，其他同测定管[7]。

蛋白酶活力单位定义：在pH 7.2和40 ℃下保温20 min，1 g仿刺参消化道 1 min水解0.5%的酪蛋白产生1 g酪氨酸即为1个蛋白酶活力单位。

1.4 稻莘治

样品的数据均采用SPSS软件进行处理，进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 盐度对仿刺参蛋白摄入量的影响

利用表观消化率进行分析，更有效地表现盐度对仿刺参蛋白摄入的影响，结果见图1。由图1可以看出，养殖水体的盐度对仿刺参蛋白摄入量有显著的影响（P

2.2 盐度对蛋白酶活力的影响

由图2可以看出，养殖水体盐度对仿刺参肠道内在的蛋白酶活力具有显著影响（P

3 小结与讨论

本研究中仿刺参摄入蛋白利用率与其内在蛋白酶的活性存在高度的相关性，盐度通过影响其内部消化道内酶的活性，来调节仿刺参对蛋白质的消化吸收。在盐度3.1%时，仿刺参蛋白酶活力最高，对蛋白的消化吸收能力最强。盐度是反映水中无机离子含量的指标，水生动物对环境的适应一般围绕其等渗点进行渗透压调节，而渗透压调节是一需要耗费能量的生理过程[3]，导致刺参生长发育受到影响[1]。盐度在3.1%时，可能处在刺参等渗点的附近，刺参用于渗透压调节的能量较少，故生长得快，吸收蛋白质的能力及肠道内蛋白酶活性最高。本研究中最适盐度3.1%是刺参生长的最适盐度，与王国利等[4]的研究结果一致。

蛋白质是水产动物发育过程重要的营养物质，水产动物的生长速度与其所摄食饲料的粗蛋白含量有密切关系，而消化酶活性的研究有助于更准确地掌握水产动物对饲料中蛋白质的需求量[8]。仿刺参体内存在多种蛋白酶，其活性不但随着季节、水温的变化而有显著的变化[9，10]，而且受盐度的影响也非常明显，盐度是反映水中无机离子含量的指标，有研究报道，无机离子直接影响酶的产生可能是盐度影响消化酶活性的主要原因之一[11]。本研究结果表明，盐度对仿刺参消化道内蛋白酶活力及蛋白质的消化率具有显著影响（P

参考文献：

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