强化阿托伐他汀对不稳定型心绞痛患者PCI围术期CD4+T淋巴细胞SOCS1表达的影响
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇强化阿托伐他汀对不稳定型心绞痛患者PCI围术期CD4+T淋巴细胞SOCS1表达的影响范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
【摘要】目的 探讨强化剂量阿托伐他汀对不稳定心绞痛患者PCI围术期CD4+T淋巴细胞SOCS1表达的影响。方法 入选广西医科大学第一附属医院住院的不稳定型心绞痛患者50例，用随机数字法分为强化他汀组（术前80 mg/d，术后40 mg/d，n=25）和常规他汀组（术前术后均20 mg/d，n=25）。分别于pci术前、术后18～24 h抽取新鲜外周血，免疫磁珠法分选出cd4+T淋巴细胞，荧光定量PCR检测socs1mRNA表达，蛋白免疫印迹法检测SOCS1蛋白表达，酶联免疫法检测IFN-γ炎症因子的表达。结果 ①与PCI术前强化组相比，术后强化组SOCS1mRNA、SOCS1蛋白表达明显升高（P0.05）③与PCI术前常规组比较，术后常规组血清IFN-γ浓度明显升高（P0.05）。结论 强化剂量的阿托伐他汀可以通过上调CD4+T淋巴细胞SOCS1的表达，从而减少PCI术后心肌的炎症反应。
【关键词】不稳定型心绞痛；阿托伐他汀；CD4+T淋巴细胞；SOCS1；IFN-γ
Effects of aggressive dosing of atorvastatin on the expression of SOCS1 in CD4+Tlymphocytes from patients with unstable angina pectoris during peri-operative period of PCI Su Qiang，Li Lang，Wang Jiangyou，Huang Weiqiang，Zhou You，Wen Weiming，Lu Yongguang. Department of Cardiology，The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China.
Corresponding author：Li Lang，Email：
【Abstract】Objective To investigate the effects of aggressive dosing of atorvastatin on the expression of SOCS1 in CD4+Tlymphocytes from patients with unstable angina pectoris during peri-operative period of PCI. Methods A cohort of 50 patients with unstable angina pectoris were randomized（random number） to give pretreatment with either an aggressive dose （80 mg/d，n=25） or a routine dose （20 mg/d，n=25） of atorvastatin. Circulating CD4+T cells were subsequently obtained prior to PCI， and also 18 h to 24 hours after PCI， using a magnetic cell sorting system （MACS）. Fluorescence-based quantitative real-time polymerase chain reaction （qRT-PCR） was used to measure expressions of SOCS1 mRNA in the isolated CD4+Tlymphocytes， and western blot analysis was used to detect levels of SOCS1 protein. Serum levels of IFN-γwere quantified using enzyme-linked immunosorbent assays （ELISAs）.Results Compared with routine dose group， the expressions of SOCS1 mRNA and protein levels were dramatically increased and those were higher in aggressive dose group following PCI （P
【Key words】Unstable angina；Atorvastatin；CD4+T lymphocytes；SOCS1；IFN-γ
经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）作为一种冠心病治疗的有效手段，能解除冠脉狭窄以及开通闭塞的冠脉，改善心绞痛及心肌梗死症状，改善心功能，提高患者生活质量，减少猝死。但术后心肌损伤（periprocedural myocardial injury，PMI）是临床常见而棘手的并发症，一旦发生则提示长期预后不良，包括病死率增高，心脏意外的发生率增高，目前临床上缺乏有效地防治方法[1-2]，探索术后心肌损伤机制与防治的研究受到人们高度重视。
研究发现，不稳定性心绞痛（unstable angina pectoris，UAP）与炎症密切相关，临床上发现UAP急性反应期可激活CD4+T淋巴细胞，并使IFN-γ等炎症因子分泌增加[3]。PCI术可激活局部的T淋巴细胞，还能导致外周血淋巴细胞的显著激活和氧化应激产物标志物的显著增高，并致使IFN-γ等炎症因子的增加，促进心肌局部炎症的发生发展[4]。细胞因子信号转导抑制剂1（suppress or of cytokine signaling，SOCS1）是固有免疫和获得性免疫的重要生理性调节因子，能够调节淋巴细胞的激活发育和分化，并致使 IFN-γ等炎症因子的分泌减少，起到抑炎的作用[5]。
ARMYDA多项研究表明，PCI术前2 d给予80 mg大剂量的阿托伐他汀，能有效降低炎症指标CRP水平，明显减少术后心肌损伤的发生率[6-9]，推测阿托伐他汀的抗炎作用可能起关键作用。目前他汀类药物在PCI术后心肌损伤中的作用机制尚未完全阐明，但术后心肌CD4+T淋巴细胞激活，诱发心肌炎症反应已经得到研究证实[10]。因此，本研究观察强化他汀对不稳定心绞痛（unstable angina pectoris， UAP）患者PCI围术期CD4+T淋巴细胞SOCS1表达的影响，以探讨他汀预防PCI术后心肌损伤作用机制，为PCI术后心肌损伤的临床防治提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2011年7月至2012年3月入住广西医科大学第一附属医院并行择期PCI的UAP患者50例（男42例，女8例），年龄（61.57±9.25）岁，随机（随机数字法）分为强化他汀组（术前2 d给予80 mg/d， 术后给予40 mg/d，n=25）和常规他汀组（术前术后均为20 mg/d，n=25）两组均为术前2 d首次服用阿托伐他汀。UAP患者均经冠脉照影证实存在冠状动脉狭窄，有行PCI指征，且心肌酶学标记物CK-MB和CTnI阴性，无他汀应用禁忌证，初发心绞痛、劳累恶化性心绞痛和静息性心绞痛。排除标准：①合并严重感染或肿瘤患者；②严重肝肾功能不全者；③他汀类药物过敏者；④脑卒中；⑤左室射血分数
1.2 采集标本
两组患者分别采集PCI前，术后18～24 h新鲜外周静脉血20 mL。20 mL中取1 mL血自然凝固20 min后，2000 r/min离心10 min，收集血清用于ELISA检测INF-γ。余下用肝素抗凝后分离细胞。本实验遵照广西医科大学伦理委员会人体试验管理规范执行，所有的病例选择和标本提取均获患者知情同意并签署同意书。
1.3 材料
人淋巴细胞分离液（索莱宝，中国），DynabeadsFlowCompTM Human CD4试剂盒（Dynal，挪威），RPMI1640培养基（Hyclone，USA），TRNzol-A+总RNA提取试剂（天根，中国）RevertAid FistStrand cDNA Synthesis kit（Fermentas，立陶宛），Fase Start Universal SYBR Green Master（Rox，USA）， SOCS1mRNA、GAPDHmRNA引物（生工，中国），兔抗人SOCS1单抗（santa cruz，USA），羊抗兔荧光二抗（LI-COR，USA），GAPDH单抗（碧云天，中国），荧光二抗（KPL，USA），蛋白Marker（Fermentas，立陶宛）， Human INF-γ Platinum ELISA（美国R&D公司）， Step-one 荧光定量基因扩增仪（ABI、美国），Odessay双色红外激光成像系统扫描仪。
1.4 细胞提取
根据Ficoll-Paque密度梯度离心法提取患者PBMC细胞，重悬于1 mL 1640培养基，取10 μLPBMC重悬细胞加90 μL PBS稀释10倍后作细胞计数，余下细胞严格按照DynabeadsFlowCompTM Human CD4磁珠分选试剂盒说明书操作分选CD4+T淋巴细胞。分选出的细胞同样做细胞计数，同时用0.4%台盼蓝染色观察并计算出活细胞存活率，存活率>90%的CD4+T淋巴细胞留下备用。
1.5 荧光定量PCR检测SOCS1mRNA表达量
按照 Trizol操作说明提取细胞的总RNA， 并用Nanodrop测量其浓度，同时用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA有无降解，调整 RNA 的量为 1 μg/μL，逆转录合成cDNA。采用SYBR GreenΙ荧光标记法检测PCR 产物，总反应体系为20 μL，SOCS1引物：上游：5’-CCGCGACTACCTGAGCTC-3’下游：5’-AGGTTACCCACATGGTTCCA-3’；GAPDH引物：上游：5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’下游：5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’，按试剂盒说明设置反应体系及参数，每个样本均做复孔检测，同时每次反应均设置阴性孔。PCR产物经过测序检测。结果采用2-ΔΔCT法比较。
1.6 Western blot 检测SOCS1蛋白的表达
分选出的CD4+T淋巴细胞中加入100 μL蛋白裂解液混匀，然后在4 ℃下1 2000 r/min离心20 min，提取上清转移至新离心管中，然后用BCA法检测蛋白浓度，内参为GAPDH。配置12%分离胶和5%浓缩胶，进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法转膜40 min，用TBST配置的5%脱脂奶粉封闭1 h，1∶2500一抗4 ℃敷育过夜，脱色摇床上用TBST洗膜5 min×5次，1∶5000红外荧光二抗室温敷育2 h后在双色红外激光成像系统扫描成像。
1.7 ELISA 检测INF-γ质量浓度
将收集的血清标本及培养基上清和ELISA试剂盒常温下放置约30 min，操作按说明书进行。
1.8 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用成组t检验。连续变量的正态性分布用Shapiro-Wilk检验。计数资料以频数及构成比表示，采用χ2检验。P
2 结果
2.1 患者基本情况比较
强化他汀组与常规他汀组在年龄、性别、吸烟史、糖尿病史、血脂异常、高血压、既往心血管病病史、药物治疗等方面差异均无统计学意义（P>0.05），见表1。强化组和常规组在冠脉病变部位、狭窄程度、数量及支架植入数等的差别均无统计学意义（均P>0.05），见表2。
2.2 各组患者SOCS1mRNA表达量的变化
①术前强化组（0.86±0.09）与常规组（0.83±0.08）之间SOCS1mRNA表达差异无统计学意义（t=1.245，P=0.219）；②与PCI术前强化组（0.86±0.09）相比，PCI术后18～24 h强化组（2.57±0.23）SOCS 1 mRNA表达明显升高（t=34.618，P=0.000）；③与术前常规组（0.83±0.08）相比，术后常规组（0.88±0.09）SOCS 1 mRNA无明显改变（t=1.661，P=0.103），见图1。
2.3 Western blot 检测各组SOCS1蛋白的表达
Western blot定量分析显示（图2）：①术前强化组（0.13±0.02）与常规组（0.12±0.01）之间SOCS1相对蛋白表达量差异无统计学意义（t=0.447，P=0.657）；②与PCI术前强化组（0.13±0.02）相比，PCI术后强化组（0.34±0.06） SOCS1相对蛋白表达量明显升高（t=38.191，P=0.000）；③与术前常规组（0.12±0.01）相比较，术后常规组（0.14±0.02）则SOCS1蛋白相对表达量无明显改变（t=1.565，P=0.124）。
2.4 血清INF-γ的质量浓度
①PCI术前强化组（229.26±35.17）pg/mL与常规组（220.27±27.59 ）pg/mL之间血清INF-γ浓度差异无统计学意义（t=1.006，P=0.320）；②与PCI术前常规组比较，术后常规组IFN-γ（285.43±40.13） pg/mL浓度明显升高（t=6.690，P=0.000）；与PCI术前强化组比较，术后强化组IFN-γ（236.27±30.46 ）pg/mL浓度稍升高，但差异无统计学意义（t=0.753，P=0.455）。
3 讨论
PCI术后心肌损伤是择期PCI术常见的并发症，发生率达30%～70%[11]，患者一旦发生术后心肌损伤，近远期心脏不良事件显著增高，提示预后不良[1]。不稳定性心绞痛（unstable angina pectoris，UAP）发生、发展过程与炎症密切相关，临床上发现UAP急性反应期可激活CD4+T淋巴细胞，激活单核细胞，后者能使胶原蛋白和弹力蛋白降解从而引起动脉粥样硬化斑块的不稳定和破裂，而PCI术更是进一步加重CD4+T淋巴细胞激活，致使IFN-γ等炎症因子的分泌增加，加重炎症反应及心肌损伤[12]。
ARMYDA研究发现，PCI术前给予大剂量的阿托伐他汀，能够有效地降低炎症因子水平及减少术后心肌损伤的发生率，明显改善患者近期预后[7]。他汀类药物能直接抑制T淋巴细胞的激活，从而下调IFN-γ等炎症因子的分泌，进而抑制炎症的发展[13]。IFN-γ主要由活化的CD4+T细胞和CD8+T细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子，参与不稳定性斑块的发生、发展过程，在促使斑块破裂及炎症损伤中起到重要的作用[14]。本研究发现PCI术前2 d给予80 mg大剂量的阿托伐他汀，能够降低PCI术后血清IFN-γ浓度上升趋势，而常规组该作用不明显。
SOCS1是人免疫系统重要的生理调节因子，在正常人体内呈低水平表达，经细胞因子刺激后可快速诱导表达，在多系统多种疾病中发挥细胞因子介导的信号转导的负调控作用，从而在某种程度上有效地阻止了疾病的进展和对组织的损伤[15]。Federici等[16]研究表明在炎症过程中，SOCS1负调控CD4+T淋巴细胞的激活，从而抑制IFN-γ等炎症因子的分泌，下调炎症反应，起到组织保护作用。Starr等[17]研究报道抑制幼鼠的SOCS1表达，幼鼠很快死于严重而复杂的全身炎症损伤，并且与IFN-γ等炎症因子过度激活密切相关。这些报道均提示，上调SOCS1的表达，可以减少IFN-γ分泌，抑制炎症反应，从而保护组织免受炎症损伤。本研究发现PCI术前2天给予80 mg大剂量的阿托伐他汀，可以上调SOCS1蛋白表达，降低血清IFN-γ浓度。而常规剂量组SOCS1蛋白表达无明显改变。以上实验结果提示，强化他汀减少术后心肌损伤，可能通过上调CD4+T淋巴细胞SOCS1的表达，进而降低IFN-γ浓度起效。表明强化他汀减少术后心肌损伤机制与上调CD4+T淋巴细胞SOCS1的表达，降低PCI术后的炎症反应有关。
SOCS1的表达接受多种不同因素的调节，主要对SOCS1的转录、翻译、蛋白等三个水平方面进行调控。在转录水平上，STAT1 （signal transducer and activator of transcription 1）直接激活IRF-1（interferonregulatory factor-1）转录因子，后者刺激并加强SOCS1基因的转录[18]。在翻译水平上，eIF4E （eukaryotic initiation factor 4e）能够增强SOCS1 mRNA5′-非翻译区，抑制SOCS1基因的翻译[19]。在蛋白水平上，抑制细胞因子信号盒（SOCS box）能够保护SOCS1 蛋白免受蛋白酶降解[20]。此外，Pim家族中的丝氨酸/苏氨酸酶能够绑定SOCS1，并使其磷酸化。而Pim酶磷酸化SOCS1后，能使SOCS1蛋白的半衰期延长。因此，强化的阿托伐他汀可能是通过上述的其中一种或者多种方式调控SOCS1的表达而起到抗炎的作用[21]。
参考文献
[1]Ellis SG， Chew D， Chan A， et al. Death following creatine kinase-MB elevation after coronary intervention： identification of an early risk period： importance of creatine kinase-MB level， completeness of revascularization， ventricular function， and probable benefit of statin therapy[J]. Circulation， 200，106（11）：1205-1210.
[2] Su Q， Li L， Liu Y， et al. Effect of metoprolol on myocardial apoptosis and caspase-9 activation after coronary microembolization in rats[J]. Exp Clin Cardiol， 2013， 4（2）： 138-143.
[3] 陆永光，李浪， 陈妍梅，等. 微小核糖核酸155对不稳定性心绞痛患者CD4+T淋巴细胞的调控作用[J]. 中华急诊医学杂志，2011， 20（9）：960-965.
[4] Sardella G， Accapezzato D， Di Roma A， et al. Integrin beta2-chain （CD18） over-expression on CD4+T cells and monocytes after ischemia/reperfusion in patients undergoing primary percutaneous revascularization[J]. Int J Immunopathol Pharmacol，2004，17（2）： 165-170.
[5] Yoshimura A， Naka T， Kubo M. SOCS proteins， cytokine signalling and immune regulation[J]. Nat Rev Immunol， 2007，7（6）：454-465.
[6] PattiG，PasceriV， ColonnaG， et al. Atorvastatin pretreatment improves outcomes in patients with acute coronary syndromes undergoing early percutaneous coronary intervention： results of the ARMYDA-ACS randomized trial[J].J Am Coll Cardiol， 2007， 49（12）： 1272-1278.
[7] Pasceri职V， Patti G， Nusca A，et al.Randomized trial of atorvastatin for reduction of myocardial damage during coronary intervention： results from the ARMYDA （Atorvastatin for Reduction of MYocardial Damage during Angioplasty） study[J]. Circulation ， 2004， 110（6）： 674-678.
[8] DiSciascio G， Patti G， Pasceri V， et al.Efficacy of atorvastatin reload in patients on chronic statin therapy undergoing percutaneous coronary intervention： results of the ARMYDA-RECAPTURE （Atorvastatin for Reduction of Myocardial Damage During Angioplasty） Randomized Trial[J].J Am CollCardiol， 2009， 54（6）： 558-565.
[9] Patti G，Chello M， Pasceri V， et al.Protection from procedural myocardial injury by atorvastatin is associated with lower levels of adhesion molecules after percutaneous coronary intervention： results from the ARMYDA-CAMs （Atorvastatin for Reduction of MYocardial Damage during Angioplasty-Cell Adhesion Molecules） substudy[J].J Am CollCardiol， 2006， 48（8）： 1560-1566.
[10]Sardella G， Accapezzato D， Di Roma A， et al.Integrin beta2-chain （CD18）over-expression on CD4+Tcells and monocytes afterischemia/reperfusion in patients undergoing primary percutaneous revascularization[J].Int J Immunopathol Pharmacol， 2004， 17（2）： 165-170.
[11]Morales-Villegas EC， Di Sciascio G， Briguori C. Statins： cardiovascular risk reduction in percutaneous coronary intervention-basic and clinical evidence of hyperacute use of statins[J].Int J Hypertens，2011： 904742.
[12]文伟明，苏强，李浪，等. 强化阿托伐他汀对不稳定型心绞痛患者PCI围术期CD4+T淋巴细胞 Sprouty1表达的影响[J]. 中华急诊医学杂志，2013， 22（8）：891-896.
[13]Bu DX， Griffin G， Lichtman A. Mechanisms for the anti-inflammatory effects of statins[J].Curr Opin Lipidol， 2011， 22（3）： 165-170.
[14]Schoenborn JR， Wilson CB. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses[J].Adv Immunol， 2007，96（1）：41-101.
[15]Liang X， He M， Chen T， et al. Multiple roles of SOCS proteins： Differential expression of SOCS1 and SOCS3 in atherosclerosis[J]. International J Mol Med， 2013， 31（5）： 1066.
[16]Federici M， Giustizieri ML， Scarponi C， et al. Impaired IFN-gamma-dependent inflammatory responses in human keratinocytes overexpressing the suppressor of cytokine signaling 1[J]. J Immunol， 2002，169（1）：434-442.
[17]Starr R， Metcalf D， Elefanty AG， et al. Liver degeneration and lymphoid deficiencies in mice lacking suppressor of cytokine signaling-1[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1998，95（4）：14395-14399.
[18]Saito H， Morita Y， Fujimoto M， et al. IFN regulatory factor-1-mediated transcriptional activation of mouse STAT-induced STAT inhibitor-1 gene promoter by IFN-gamma[J]. J Immunol， 2000，164（11）：5833-5843.
[19]Gregorieff A， Pyronnet S， Sonenberg N， et al. Regulation of SOCS-1 expression by translational repression[J]. J Biol Chem， 2000，275（28）：21596-21604.
[20]Narazaki M， Fujimoto M， Matsumoto T， et al. Three distinct domains of SSI-1/SOCS-1/JAB protein are required for its suppression of interleukin 6 signaling[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1998，95（22）：13130-13134.
[21]Chen XP， Losman JA， Cowan S， et al. Pim serine/threonine kinases regulate the stability of Socs-1 protein[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2002，99（4）：2175-2180.
（收稿日期：2013-11-04）