乌头块根浸提液对3种牧草的化感效应
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[摘要] 乌头Aconitum carmichaeli是传统的大宗中药材之一，广泛种植于四川省江油市，所释放的化感物质严重影响周围和后茬作物的生长发育。试验以当地种植乌头的后茬牧草白三叶、黑麦草和紫花苜蓿为材料，研究了乌头块根浸提液（ETR）浸种对种子萌发和幼苗生长的化感效应。结果表明，牧草品种不同，种子发芽和幼苗生长对ETR浓度的响应也不一样。低浓度的ETR（0.01 g・L-1 ）促进紫花苜蓿种子发芽，ETR 1.00 g・L-1对3种牧草的种子发芽率均有抑制作用。用高浓度的ETR （1.00 g・L-1）浸种，苗高的最大降幅为：紫花苜蓿（42.05%）≥白三叶（40.21%）> 黑麦草（10.64%）。因此，在乌头-牧草种植体系中，选择对ETR相对不敏感的黑麦草有益于减轻乌头产生的化感效应，提高土地整体生产力。随ETR浸种浓度提高，抑制牧草种子中的蛋白质、淀粉和肌醇磷酸盐水解，降低游离氨基酸、可溶性糖和可溶性磷含量，进而影响种子发芽。此外，高浓度的ETR还显著降低牧草幼苗的根系活力、硝酸还原酶活性和叶绿素含量，说明ETR中的化感成分可抑制养分吸收，硝酸盐同化和光合作用，妨碍幼苗生长。
[关键词] 乌头；浸提液；牧草；化感效应
[Abstract] The tuberous roots of Aconitum carmichaeli are largely used in traditional Chinese medicine and widely grown in Jiangyou， Sichuan， China. During the growth process， this medicinal plant releases a large amount of allelochemicals into soil， which retard the growth and development of near and late crops. Therefore，a pure culture experiment was thus carried out by seed soaking to study the allelopathic effects of extracts from tuberous roots of A. carmichaeli （ETR） on the seed germination and young seedling growth of Lolium perenne， Trifolium repens， and Medicago sativa， the late pasture grasses after cultivation of A. carmichaeli. The results showed that three pasture grasses varied significantly in seed germination and young seedling growth in response to ETR concentrations. Seed germination of M. sativa was stimulated by low ERT concentration （0.01 g・L-1）， while all of pasture grass seeds germinated poorly in solution with 1.00 g・L-1. Seed soaking with 1.00 g・L-1 also inhibited significantly the growth of pasture young seedlings， with M. sativa showing the highest seedling height reduction of 42.05% in seeding height， followed by T. repens （40.21%） and L. perenne with about 11%. Cultivation of L. perenne could thus be beneficial to increase whole land productivity in A. carmichaeli-pasture grass cropping systems. In addition， hydrolysis of protein， starch， and inositol phosphates was blocked and free amino acids， soluble sugars and phosphorus were decreased in seeds by seed soaking with ETR， which could be one of the reason for the inhibition of seed germination. There was a significant reduction in root vigor， nitrate reductase， and chlorophyll after the seed treatment with ETR， indicating the suppression of nutrient uptake， nitrate assimilation， and photosynthesis by allelopathic chemicals in ETR， which could lead to the slow growth rate of pasture grass seedlings.
[Key words] Aconitum carmichaeli； extracts of fibrous root； pasture grass； allelopathic effect
doi：10.4268/cjcmm20152107
乌头Aconitum carmichaeli Debx属毛茛科多年生草本植物，块根入药，具有强心、镇痛、抗炎、降低血糖、局部麻醉、兴奋垂体-肾上腺皮质系统等多种作用，是传统的大宗地道中药材之一[1-2]。其中，乌头碱、中乌头碱和次乌头碱等双酯型生物碱是乌头块根中的有效和毒性成分，其含量较高，也可能是乌头生长过程中向环境释放的重要化感物质[3]。
药用植物通过根系分泌向土壤释放化感物质的现象十分普遍。在种植黄花蒿的非洲和北欧土壤中，青蒿素可达11.7～25 mg・kg-1[4-5]，抑制小麦、玉米、莴苣、萝卜、油菜、甘蓝等多种作物的种子发芽和幼苗生长，造成减产[6-8]，并对绿藻产生较强的毒害作用[9]。黄连根系内含小檗碱、黄连碱、甲基黄连碱等多种生物碱，显著降低蚕豆、豌豆、萝卜等多种作物的种子发芽率和幼苗生长速率[10]。在生产实践中人们也发现，种植乌头的周围和后茬作物生长欠佳，产量降低。
植物释放的化感物质对周围其它植物产生有利或有害作用，使之处于生存竞争的优势地位，有利于扩大自己的生存空间和种群数量[11]。研究化感作用可了解生态系统中植物群落的发生、发展和演替规律，调控植物生长发育，减轻化感危害[12]。四川省江油市种植乌头的历史悠久，是我国道地乌头药材的主产区，约占全国乌头总产量的70%，种植乌头对周围和后茬作物的影响尚待评估。为此，论文作者选择当地乌头种植的后茬牧草――黑麦草、白三叶和紫花苜蓿为对象，研究了乌头块根提取物对种子萌发、幼苗生长和部分生理指标的影响，旨在了解乌头的化感作用，为减轻化感效应和保持土地生产力提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试牧草种子分别为黑麦草Lolium perenne、白三叶Trifolium repens和紫花苜蓿Medicago sativa，由西南大学动物科学学院提供。
乌头块根由四川省江油市药材加工厂提供，（40±1） ℃烘干至恒重，粉碎过2 mm筛，其中的双酯型生物碱（diester-alkaloids，DEA）为0.55 g・kg-1 [13]。准确称取10.000 g，加100 mL蒸馏水，40 ℃振荡浸提（150 r・min-1，4 h），抽滤，滤液用蒸馏水定容至100 mL，获得乌头块根浸提液（extracts from tuberous roots of Aconitum carmichaeli，ETR），相当于每1 mL含100 mg ETR或55 μg DEA。
1.2 试验设计
选取均匀一致的牧草种子，1.0 % H2O2消毒1 min，去离子水洗净，分别置于无（对照）、低、中、高，即ETR 0，0.01，0.10，1.00 g・L-1的浸提溶液中，25 ℃吸涨24 h。然后取50粒种子，置于直径10 cm、底部铺有3层滤纸培养皿中，进行种子发芽和幼苗培养（25±1） ℃，光暗周期12 h，光照强度5 000 lx，每天适量补充去离子水和Hoagland营养液），试验重复4次。
1.3 测定项目
以胚根长度达到1 mm为标准，每隔24 h统计一次种子的发芽数，如连续2 d发芽种子数无增长视为发芽完全，种子发芽率=（发芽的种子总数/供试种子总数）×100%。
在种子吸涨48 h时，取出部分种子，用硫酸-过氧化氢消化，钼蓝比色法测定全磷，水浸提-钼蓝比色法测定可溶性磷[14]；用蒽酮比色法测定可溶性糖，酸解-蒽酮比色法测定淀粉含量；用考马斯亮蓝法测定蛋白质，水合茚三酮法测定游离氨基酸总量[15]。
在培养14 d时，用直尺测定苗高和最大根长，TTC法测定根系活力，磺胺-萘胺比色法测定叶片硝酸还原酶活性，丙酮浸提-分光光度计法测定叶绿素含量[15]。
1.4 数据处理
用Excel 2003对试验数据进行基本计算，DPS 6.50软件进行统计分析，显着水平设置为P≤0.05。
2 结果与分析
2.1 ETR对种子发芽与幼苗生长的影响
牧草品种不同，种子发芽和幼苗生长对ETR浓度的响应也不一样。低浓度的ETR（0.01 g・L-1）促进紫花苜宿种子发芽；用ETR 1.00 g・L-1（高浓度）浸种，3种牧草的种子发芽率比对照降低36.31%～49.42%。此外，低浓度的ETR促进白三叶和紫花苜蓿的幼苗生长，0.10 g・L-1（中等浓度）对黑麦草幼苗生长有刺激作用，但高浓度均会抑制幼苗生长，苗高的最大降幅紫花苜蓿（42.05%）≥白三叶（40.21%）> 黑麦草（10.64%），根长变化与之类似，见表1。
2.2 ETR对牧草种子内含物的影响
ETR浸种对牧草种子蛋白质、可溶性氨基酸、淀粉、可溶性糖、全磷和可溶性磷含量的影响见图1。
2.2.1 淀粉与可溶性糖 随ETR浸种浓度的提高，黑麦草和白三叶种子的淀粉含量呈逐渐增加的趋势，但紫花苜蓿无显著变化。相反，与对照相比，种子可溶性糖含量则随ETR浓度的提高呈降低趋势（用0.01，0.10 g・L-1处理白三叶例外），最大降幅可达28.72%～63.53%。
2.2.2 蛋白质与游离氨基酸 与淀粉和可溶性糖的变化相似，随ETR浸种浓度的提高，黑麦草和紫花苜蓿种子种的蛋白质含量提高，但白三叶无显著变化。相反，与对照相比，种子可溶性氨基酸含量则随ETR浓度提高呈降低趋势，最大降幅可达23.94%～64.03%。
2.2.3 全磷与可溶性磷 用ETR浸种48 h后，黑麦草和白三叶种子中的全磷含量随ETR浓度的提高呈逐渐增加的趋势，紫花苜蓿则无显著变化。相反，与对照相比，种子可溶性磷含量则随ETR浓度的提高呈降低趋势（用0.01，0.10 g・L-1处理白三叶例外），最大降幅为33.09%～64.98%。
2.3 ETR对幼苗生理指标的影响
ETR对牧草幼生理指标的影响因品种和ETR浓度不同而异。与不加ETR（对照）的处理相比，中等浓度的ETR对黑麦草根系活力无显著影响，但显著提高硝酸还原酶活性和叶绿素含量；用高浓度的ETR浸种后，其根系活力、硝酸还原酶活性和叶绿素含量依次比对照降低61.53%，39.84%，33.87%。但对白三叶和紫花苜蓿而言，低浓度的ETR提高根系活力、硝酸还原酶活性和叶绿素含量；高浓度的ETR则相反，依次比对照降低88.73%～89.37%，10.82%～58.59%，31.54%～56.34%，见表2。
3 讨论
药用植物释放化感物质抑制其他植物生长的现象十分普遍[16-19]。广藿香的根系分泌物对萝卜生长具有抑制作用[20]。黄花蒿能通过茎叶淋溶，根系分泌和植物残体等途径向土壤释放青蒿素类化感物质，抑制燕麦、黄瓜、菜豆和大白菜等多种作物的种子发芽和幼苗生长[21-23]；对蚯蚓的半致死浓度LD50仅1.24 mg・L-1，远远低于黄花蒿土壤中的青蒿素（11.7～25 mg・kg-1）[4，24]；但低浓度的青蒿素促进穿心莲和甜菜的生长发育，高浓度仍具抑制作用[25]。此外，低浓度的黄连根系浸提液对豌豆和蚕豆种子发芽率无显著影响，但随处理浓度的提高，抑制种子发芽和幼苗生长[10]。与之类似，ETR对3种牧草的种子发芽和幼苗生长也呈现“低促高抑”的现象，说明在乌头生长过程中，大量释放的化感物质可直接或间接抑制周围及后茬作物的生长，造成减产，但有益于扩大自己的生存空间和种群数量，使之处于生存竞争的优势地位[10]。值得注意的是，ETR对黑麦草种子发芽和幼苗生长的影响显著小于白三叶和紫花苜宿，前者对幼苗生长的抑制率仅10%左右，后两者超过40%，表现出明显的种间差异。因此，在乌头-牧草种植系统中，选择对ETR相对不敏感的黑麦草，有益于提高整体生产水平。此外，根据ETR对植物生长的促抑作用可能开发出新型天然源植物生长调节剂，促进或抑制植物生长，提高作物产量或防控杂草。
在种子发芽时，胚乳中的淀粉和蛋白质分别水解为单糖和氨基酸，然后再经合成作用构建植物体[26]。在本研究中，随着ETR浓度的逐渐增加，牧草种子的蛋白质和淀粉含量增加或无显著变化，而游离氨基酸和可溶性糖均呈降低趋势。说明ETR可能抑制胚乳中蛋白质和淀粉的水解，导致游离氨基酸和可溶性糖的含量减少，缺乏构建新植物体的前体，进而影响种子的萌发；在种子发芽过程中，胚乳中的肌醇磷酸钙镁盐水解为可溶性磷，供给幼苗磷素营养[27]。随着ETR浓度增加，在种子发芽和幼苗生长受到抑制的同时，可溶性磷的含量在降低，说明ETR中的化感物质可能抑制了肌醇磷酸钙镁盐的水解，减少磷素营养的供应。
根系活力是根系内多种呼吸酶活性的综合体现，与养分吸收密切相关[28]，根系活力强，有益于养分吸收[29]；硝酸还原酶催化植物氮素同化的原初反应――硝酸盐同化，是植物利用氮素的关键酶之一[30]；叶绿素参与光能的吸收，对光合速率的影响甚大[31]；其含量高低通常还能指示植物氮素营养的丰缺状况[32]。用ETR 0.10～1.00 g・L-1浸种，不同程度地降低3种牧草幼苗的根系活力、硝酸还原酶活性和叶绿素含量，说明可能ETR中的化感物质可能妨碍养分吸收，氮素供应、氮素同化和干物质积累，这可能是ETR抑制幼苗生长的原因之一。
总之，ETR抑制供试牧草种子发芽和幼苗生长，并表现出明显的浓度效应和种间差异。ETR抑制种子蛋白质、淀粉和肌醇磷酸钙镁盐水解，降低根系活力、硝酸还原酶活性和叶绿素含量可能是抑制种子发芽和幼苗生长的原因之一。
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