基质金属蛋白酶1、9基因多态性与成人脑星形细胞瘤
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【摘要】 目的 本研究旨在探索mmp?1、mmp?9基因启动子区单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, snps)与脑星形细胞瘤易感性的关系。方法 以聚合酶链反应?限制性片段长度多态性分析方法，检测236例成人星形细胞瘤及366例健康对照的mmp?1 ?1607 2g/1g及mmp?9 ?1562 c/t多态性的基因型。结果 (1)mmp?1 ?1607 2g/1g snp等位基因型及基因型总体分布在星形细胞瘤患者组和健康对照组之间有显著性差异（p值分别为0.002和＜0.001）。与2g/2g基因型相比，1g/1g基因型可显著降低该肿瘤的发病风险（校正or=0.58，95%ci=0.42～0.79），而2g/1g基因型对该肿瘤的易感性无显著影响（校正or=0.74，95%ci=0.51～1.08）。根据性别、发病年龄（≤45岁或＞45岁）进行的分层分析显示了相似的结果。(2) mmp?9 ?1562 c/t的等位基因型及基因型总体分布在肿瘤患者组和健康对照组之间差异无统计学意义（p值分别为0.926和0.818）。与c/c基因型相比，c/t+t/t基因型不能改变星形细胞瘤的发病风险（校正or=1.09，95%ci=0.73～1.64）。根据性别、发病年龄、病理分级进行的分层分析，也未发现mmp?9 snp与星形细胞瘤的发病风险相关。结论 mmp?1?1607 2g/1g多态性与星形细胞瘤的易感性有关，而mmp?9?1562 c/t多态性可能不是该肿瘤的独立易感因素。
脑胶质瘤（glioma）是最常见的原发性脑肿瘤，星形细胞瘤（astrocytoma）为其主要病理类型，其病因至今未明，有报道显示可能与接触大剂量放射性物质等因素有关[1]。最近研究提示，遗传基础可能为脑胶质瘤发生的重要因素，表现在：（1）部分脑胶质瘤存在家族聚集性[2]；（2）其发病与哮喘等变态反应疾病的发生成负相关[3]；（3）一些基因多态性可能影响该肿瘤的发病风险[4,5]。
研究显示，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，mmps）基因启动子区的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, snps)可通过影响mrna转录或蛋白质表达水平而影响mmps的功能，从而影响肿瘤的发生、发展及预后。本课题组以往的研究表明，基质溶解素（mmp?7）的?181a/g多态与星形细胞瘤易感性增高有关，而间质溶素1（mmp?3）?1171 5a/6a多态与此肿瘤的易感性无关[6]。
本研究进一步探讨了间质胶原酶（mmp?1）?1607 2g/1g和明胶酶b（mmp?9）?1562 c/t snp与星形细胞瘤易感性的关系。
1 资料与方法
1.1 研究对象
236例成人脑星形细胞瘤病例为2004年1月～2006年1月在河北医科大学第二医院神经外科手术治疗的患者，术前未经过放、化治疗。其中包括who星形细胞瘤ⅰ级32 例，ⅱ级101例，ⅲ级73 例，ⅳ级30例。366例健康对照为同期河北省血站献血员或在河北医科大学第二医院门诊查体人员，无肿瘤及遗传病史。所有患者及健康对照均来自河北省中南部地区，并均为汉族、无血缘关系。
1.2 标本采集及dna提取
抽取健康对照外周静脉血5ml，经枸橼酸钠抗凝，于4℃冰箱保存，并于采血后1周内以蛋白酶k消化?饱和氯化钠盐析法提取白细胞dna。取10～20片10μm厚的星形细胞瘤患者的石蜡包埋手术标本，经梯度酒精脱蜡后，以蛋白酶k消化、酚?氯仿抽提法提取肿瘤组织dna。随机选取100例星形细胞瘤患者，同时抽取外周静脉血5ml并提取外周血白细胞dna。
1.3 mmp?1、mmp?9基因分型
mmps基因型检测应用聚合酶链反应?限制性片段长度多态性分析（polymerase chain reaction?restriction fragment length polymorphism，pcr?rflp）方法进行。
mmp?1 ?1607 2g/1g snp上下游扩增引物分别为5′?tgacttttaaaacatagtctatgttca?3′和5′?tcttggattgatttgagataagtcatagc?3′。人工将下游引物靠近3′末端的第二个碱基t为g所替代，从而产生一个aluⅰ（agct）限制性酶切位点。1g等位基因存在该识别位点，而2g等位基因由于g的插入而无法被该酶识别。
mmp?9 ?1562 c/t snp上下游扩增引物分别为5′? gcctggcacatagtaggccc?3′和5′? cttcctagccagccggcatc?3′。人工将下游引物靠近3′末端的碱基c为t所替代，从而产生一个sphⅰ（gcacgc）限制性酶切位点。c等位基因存在该识别位点，而t等位基因则不能被该酶识别。
pcr反应在pcr扩增仪（eppendorf公司，authorized thermal cycler）中进行。反应体系均为25μl，其中模板dna 100ng，10×pcr缓冲液2.5μl，taq?dna聚合酶（博大泰克公司）2.5u，mgcl2 2.0mm，dntps 0.2mm，上、下游引物各0.2μm。pcr反应条件为：94℃预变性5min，94℃ 30s，58℃ （mmp?1）或62℃ （mmp?9）30s，72℃ 60s，35个循环后，72℃延伸5min。
取8μl pcr产物分别以10u aluⅰ或sphⅰ（上海生工公司）在37℃过夜消化，经4%琼脂糖凝胶电泳分析基因型。mmp?1 pcr产物经酶切后，2g等位基因显示一条带（269bp），1g等位基因则产生两条带（241和28bp）。mmp?9 pcr产物经酶切后，t等位基因显示一条带（435bp），c等位基因则产生两条带（247和188bp）。
为进行实验质控，每一批pcr反应都以双蒸水代替模板作阴性对照，每一批酶切反应均以已知的mmp?1 1g/1g或mmp?9 c/c基因型标本作pcr产物完全消化对照，随机抽取10%的样本进行两次基因型分析。
1.4 统计学分析
应用卡方检验比较对照组及病例组基因型频率的观察值与预期值进行hardy?weinberg平衡检验。病例组与对照组的基因型、等位基因型分布比较均采用四格表卡方检验。以非条件logistic回归法计算表示相对风险度的比值比（odds ratio，or）及其95%的可信区间（confidence interval，ci），并经性别和（或）年龄校正。数据统计分析采用spss软件包（12.0版）进行。p<0.05为有统计学意义。表1 星形细胞瘤与健康对照组mmp?1 和mmp?9 snp分布特征
2 结果
2.1 研究对象的一般特征
星形细胞瘤患者及健康对照组的人口学特征见表1。肿瘤患者组的性别及年龄分布与健康对照组无显著性差异（p＞0.05）。所有健康对照、221例星形细胞瘤患者的dna成功进行了mmp?1、mmp?9基因分型。100例肿瘤患者的外周血dna mmp?1、mmp?9基因分型结果与肿瘤组织dna分型结果完全一致。健康对照组的mmp?9基因型分布均符合hardy?weinberg平衡（p＞0.05）；而健康对照组的mmp?1基因型分布不符合hardy?weinberg平衡（p＝0.001）。
2.2 mmp?1基因分型结果
mmp?1?1607 2g/1g snp的等位基因型及基因型总体分布在星形细胞瘤患者组和健康对照组之间有显著性差异（p值分别为0.002和＜0.001）。肿瘤患者组mmp?1 1g/1g 基因型频率显著低于健康对照组（p值=0.004），见表1。与人群中占分布优势的2g/2g基因型相比，1g/1g基因型可显著降低该肿瘤的发病风险，经性别、年龄校正的or值为0.58（95%ci为0.42～0.79），而2g/1g基因型对该肿瘤的易感性无显著影响。根据性别、发病年龄（≤45岁或＞45岁）进行的分层分析显示了相似的结果。根据who病理分级进行的分层分析显示，除ⅳ级肿瘤外，1g/1g基因型均可显著降低ⅰ～ⅲ级肿瘤的发病风险，见表2。
2.3 mmp?9基因分型结果
mmp?9 ?1562 c/t snp的等位基因型及基因型总体分布在肿瘤患者组和健康对照组之间无显著性差异（p值分别为0.926和0.818）。由于t/t基表2 mmp?1 snp与星形细胞瘤易感性的相关分析
a、b：以2g/2g基因型为参照，2g/1g (a) 或1g/1g (b)基因型发生星形细胞瘤的相对风险度［经年龄和（或）性别调整的比值比］因型例数很少，故将c/t基因型与t/t基因型合并进行统计学分析，见表1。与c/c基因型相比，c/t+t/t基因型不能改变星形细胞瘤的发病风险（经性别、年龄校正or值为1.09，95%ci为0.73～1.64）。根据性别、发病年龄、who病理分级进行的分层分析，也未发现c/t+t/t基因型与胶质瘤的发病风险相关，见表3。表3 mmp?9 snp与星形细胞瘤易感性的相关分析
3 讨论
早期认为，mmps仅参与肿瘤的侵袭和转移，近年研究显示，mmps可通过调节细胞生长和凋亡、影响血管生成和免疫监视等途径，在肿瘤形成早期起重要作用[7]。
mmp?1基因定位于染色体11q22?33，其?1607 2g/1g snp可通过插入一个g碱基而产生一个转录因子ets家族成员的功能性结合位点，从而增强基因的转录活性。在对乳腺癌[8]、宫颈癌[9]、肾细胞癌[10]、结肠癌[11]、肺癌[12]的研究中，发现mmp?1 2g可增加肿瘤的易感性或促进肿瘤的侵袭转移。最近，mccready等[13]的研究也显示，多形性胶质母细胞瘤组织中的mmp?1 2g/2g 基因型频率显著高于健康对照组，且肿瘤组织mmp?1的mrna和蛋白水平显著高于正常脑组织，提示mmp?1 2g/1g snp可能在胶质母细胞瘤形成和侵袭中发挥作用。本研究发现，与人群中占分布优势的2g/2g基因型相比，1g/1g基因型可显著降低该肿瘤的发病风险，而携带2g/1g基因型对该肿瘤的发病风险无显著影响，说明mmp?1 1g等位基因型与脑胶质瘤易感性的关系存在剂量效应。本研究还发现，1g/1g基因型对胶质瘤发病风险的影响仅限于ⅰ～ⅲ级肿瘤，而与mccready等的研究结果不同，本研究未发现mmp?1 2g/1g snp对以多形性胶质母细胞瘤为主的ⅳ级胶质瘤发病的影响，其原因可能与分层分析后的样本量较少有关，也有此基因多态性对ⅳ级胶质瘤发病的影响存在种族差异的可能。为明确mmp?1 2g/1g snp与脑胶质瘤发生、发展的关系，有必要进一步扩大样本量，并进行基因型与mmp?1 mrna转录和蛋白表达关系的研究。
在本研究中，健康对照组的mmp?1基因型分布不符合hardy?weinberg平衡，此结果与对日本人[14]和高加索人[12]的研究结果一致，但原因未明。由于本研究随机选取的健康对照样本量较大，个体间无血缘关系，且来源于与病例组相同地区；采用的基因分型方法稳定，可重复性强；此人群的其他mmps多态性基因的分布均符合hardy?weinberg平衡[6]，因此采用此人群作为对照组是合理的。
mmp?9是mmps中分子量最大的酶，它一方面降解、破坏靠近肿瘤组织的ecm，使肿瘤细胞沿着缺损的基底膜向周围组织浸润，另一方面则通过调节毛细血管内生、新生血管生成等促进肿瘤生成、侵润和转移。mmp?9 ?1562 位snp中ct改变破坏了抑制因子的识别结合序列，从而显著增加了启动子的活性[15]。有研究提示，此mmp?9 多态性可能与乳腺癌[16]、胃癌[17]的易感性及预后有关。本研究是国际上对mmp?9 snp与脑胶质瘤易感性关系的首次报道，总体分析和分层分析均未发现?1562 c/t多态性与星形细胞瘤的发病有显著相关，说明此多态性可能不影响该肿瘤的易感性。
总之，本研究提示，mmp?1 ?1607 2g/1g多态性可能与星形细胞瘤的易感性有关，而mmp?9 ?1562 c/t多态性可能不是该肿瘤的独立易感因素。
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