肺纤方对肺纤维化大鼠血清细胞因子表达的影响

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摘要：目的 观察肺纤方对博来霉素所致肺纤维化大鼠血清肿瘤坏死因子（TNF-α）、血小板衍生生长因子（PDGF）和转化生长因子（TGF-β1）的影响，并探讨其作用机理。方法 144只健康Wistar大鼠随机分成空白组、模型组、阳性组及肺纤方高、中、低剂量组，每组24只。按Szapiel法建立模型，次日灌胃给药。空白组与模型组给予等量生理盐水，阳性组用醋酸泼尼松混悬液（6 mg/kg）灌胃，肺纤方高、中、低剂量组（3.2、1.6、0.8 g/kg）均为10 mL/kg药液灌胃，1次/d，给药21 d。分别在造模后第7、21日后分2次取材，每次随机杀检10只。腹主动脉取血，采用ELISA法检测TNF-α、PDGF和TGF-β1。结果 与模型组比较，阳性组和肺纤方各组TGF-β1、PDGF和TNF-α明显降低（P

关键词：肺纤方；博来霉素；肺纤维化；细胞因子；大鼠

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）04-0038-03

特发性肺纤维化（IPF）是原因不明的、以普通型间质性肺炎（UIP）为特征性病理改变的一种慢性纤维化性间质性肺疾病。本实验采用博来霉素复制大鼠肺纤维化模型，在纤维化形成阶段应用肺纤方干预，旨在探讨肺纤方对实验性肺间质纤维化的治疗作用，并从细胞因子的角度探讨肺纤方干预肺纤维化的作用机理。 1 实验材料

1.1 动物

清洁级健康Wistar大鼠144只，雌雄各半，体质量（200±20）g，山西省中医院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK （晋）2009-10。

1.2 药物

肺纤方由柴胡、黄芩、党参、半夏、天花粉、五味子、干姜等组成，中药材由本院门诊药房提供，经煎煮、减压浓缩、干燥、称重、制粒成型（批号20091013）；博来霉素（BLM）A5（哈尔滨博莱制药有限公司生产，批号090607）；醋酸泼尼松片（天津太平洋制药有限公司生产，批号090707）。

1.3 试剂

肿瘤坏死因子（TNF-α）、血小板衍生生长因子（PDGF）和转化生长因子（TGF-β1）ELISA试剂盒均由武汉博士德生物技术有限公司生产，批号分别为20091205、20091205、20091205。

1.4 仪器

TEC2800石蜡包埋机（湖北泰康），生物组织切片机（上海京工），生物组织脱水机（北京宇艾奇），Olympus CK-2倒置显微镜（北京长恒荣）。

2 实验方法

2.1 造模及分组

将大鼠随机分成空白组、模型组、阳性组及肺纤方高、中、低剂量组，按Szapiel法[1]建立模型。20%乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠，将其仰卧固定于大鼠实验台上，消毒后切开颈部皮肤，逐层分离，充分暴露气管，模型组及各治疗组用1 mL注射器向气管内缓慢注入稀释的BLM A5溶液，空白对照组注入等容量生理盐水，注射后立即将动物直立并旋转，使药物均匀散布于双肺内，然后逐层缝合，常规关口，创口消毒，置于实验室内保温喂养，待其自行苏醒，实验期间动物自由饮水和进食。

2.2 给药

造模后第2日，开始灌胃，每次10 mL/kg。肺纤方低、中、高剂量组分别给予相应浓度的肺纤方药液（0.8、1.6、3.2 g/kg），相当于1.45、0.73、0.36 g原药材/mL（以浸膏含量计算，相当于人临床日用剂量的15、7.5、3.75倍）；阳性组给予醋酸泼尼松混悬液（6 mg/kg），相当于人临床日用剂量48 mg的7.5倍；空白组与模型组给予等量生理盐水灌胃。均1次/d，给药21 d。

2.3 检测指标

于第7、21日，用20%乌拉坦腹腔注射麻醉、固定大鼠，暴露其腹腔，用5 mL注射器于动物腹主动脉取血4 mL。室温静置标本2 h，4 ℃、3 000 r/min离心15 min分离血清，存放于-70 ℃冰箱。TNF-α：采用ABC-ELISA方法检测。严格按照试剂盒提供的方法、步骤进行反应。在450 nm处，用酶联仪测吸光值（OD），与标准曲线比较，确定TNF-α的含量。PDGF：采用ELISA法进行检测。将血清标本稀释5 000倍，严格按照试剂盒说明书的操作步骤进行反应。在450 nm处，用酶标仪测吸光值（OD），与标准曲线比较，确定PDGF的含量。TGF-β1：采用ABC-ELISA法检测。严格按照试剂盒提供的方法进行反应。在450 nm处，用酶标仪测吸光值（OD），与标准曲线比较确定TGF-β1含量。

3 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，计量资料以―x±s表示，组间数据比较采用方差分析及LSD-t检验，等级资料采用Ridit分析，检验水准α=0.05。

4 结果（见表1）

5 讨论

目前研究显示，IPF主要由两条不同的途径引发：炎症途径和肺泡上皮细胞途径。前者释放炎症介质和黏附分子，后者出现上皮细胞损伤、增生和凋亡，二者均可以启动纤维化过程。这两条途径的后期发展过程基本一致，都是在多种细胞因子和生长因子的作用下，实现纤维组织的增生，完成肺实质的重塑。其中的上皮途径是肺泡上皮细胞受损后，启动上皮细胞反复修复机制，释放多种细胞因子和生长因子，促进上皮细胞和成纤维细胞向肌成纤维细胞转化、胶原和细胞外基质沉积，最终形成纤维化[2]。这与传统认为的肺泡上皮是“受害者”不同，肺泡上皮由被动的旁观者变成了肺纤维化形成中积极的“参与者”[3]。

细胞因子及其网络对肺纤维化的形成和发展具有重要作用，这一领域已经成为研究治疗IPF的热点。目前作为治疗IPF靶点研究较多的有TGF-β、PDGF、TNF-α、干扰素-γ1b （IFN-γ1b）、白细胞介素-10（IL-10）及血管内皮生长因子（VEGF）等。

在这些参与肺纤维化的细胞因子网络中，TGF-β是研究最深入、最重要的致纤维化的细胞因子，也是开展新的抗纤维化治疗的理想靶位[4]。TGF-β有3种亚型，其中TGF-β1是其最早被分离出来，同时也是最重要的亚型。TGF-β1在肺纤维化的形成和发展中起关键性作用。在肺纤维化发病过程中，炎症和损伤都可以诱导TGF-β1的活化和表达。在各种实验模型和临床纤维化疾病中[5-7]，TGF-β1常持续上升，它能促进成纤维细胞分裂增殖并趋向成熟分化，刺激成纤维细胞合成大量的I、Ⅱ、Ⅳ型胶原蛋白。尤其是Ⅳ型胶原蛋白，它既增加肺间质的胶原成分，增加蛋白酶抑制物的形成，又抑制胶原蛋白分解酶及纤溶酶原激活物的合成，从而减少肺间质细胞外基质（ECM）的降解，造成ECM调节失控。可见TGF-β1的生物活性与肺间质ECM生成密切相关，抑制TGF-β1的生物活性可抑制肺间质ECM生成，一定程度上阻止肺纤维化。因此，降低TGF-β1水平，有助于肺间质纤维化的防治。目前，TGF-β单克隆抗体已经开始应用于临床试验。

TNF-α是一种细胞毒细胞因子，涉及肺纤维化的多个方面。它不但能促进炎症细胞的聚集、浸润及溶体酶的释放，对周围细胞产生毒性作用，还能促进成纤维细胞的增殖及胶原的合成与分泌等[8]。TNF-α还间接通过TGF-β1或PDGF诱导途径，促进成纤维细胞增生、分化和胶原转录，大量的TNF-α可诱导肺泡上皮细胞凋亡，而肺泡和细支气管上皮细胞凋亡可能会引起肺纤维化反应。因此，在治疗肺纤维化时，抗TNF-α可作为一项选择。

PDGF的主要生物学效应之一是促细胞分裂。PDGF对成纤维细胞具有强烈的趋化作用和致有丝分裂活性，不仅能促进分离的成纤维细胞增殖，而且使其Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型前胶原合成增加。PDGF通过靶细胞膜上的PDGF受体发挥作用。PDGF受体通过促进成纤维细胞增殖和胶原合成，影响肺组织的纤维化进程，该受体磷酸化引发的信号转导被认为是肺纤维化发病机制中的一个重要环节[9]。

根据肺纤纤维化的临床表现，除咳嗽、咯痰、胸闷气喘外，大多具有口苦、咽干、头晕、纳差等中医六经辨证中的少阳证。少阳证的来源，不外乎外邪直中或传变而来。这种来源与目前研究中所显示的、IPF发生的两条途径即炎症途径和肺泡上皮细胞途径似乎不谋而合。外邪直中少阳，入则热，出则寒，其往来寒热与咳嗽相伴发生；或由太阳、阳明传变而来，则会兼见太阳或阳明之证。无论如何，三阳经证均起因于外邪，与肺密切相关，出现肺之“在声为咳”之咳喘，值得深思。

肺纤方的药物组成涉及中医六经辨证用药的太阳和少阳。近年有研究报道，柴胡皂苷d对BLM诱导的肺纤维化小鼠有治疗作用[10]。肺纤方的君药即为柴胡。柴胡味苦，性平，入肝、胆经，可透泄少阳之邪，并能疏泄气机之郁滞，使少阳半表之邪得以疏散，为君药。黄芩苦寒，清泄少阳半表之热，为臣药。柴胡之升散，得黄芩之降泄，二者相伍，是和解少阳的基本结构。邪从太阳传入少阳，源于正气本虚，故用桂枝祛太阳之邪，用党参、大枣益气健脾，后二者一来可以扶正以驱邪，二来可益气以抵御邪气内传，使正气旺盛，则邪无内传之机。五味子、干姜温肺散寒，则咳喘自止，痰涎自化；瓜蒌仁宽胸理气，则胸闷得除；天花粉、桔梗利咽，则咽干得解；炙甘草助党参、大枣扶正，并能调和诸药。诸药合用，具有祛除外邪、平调寒热、宣肃肺气、止咳平喘的功效。

本实验结果表明，第7、21日，大鼠（生理状态下）血清TGF-β1、PDGF和TNF-α的表达变化不大；BLM A5造模后，血清中这三者的含量均显著增加（P

肺纤方各组TGF-β1、PDGF和TNF-α的表达范围及强度较模型组和阳性组降低。在第7日，低剂量组与阳性组基本相当，随着时间的延长，到第21日，高剂量组显示了好于阳性组的效果。这就提示，肺纤方中、高剂量组抑制肺纤维化效果明显优于阳性组，且呈现一定的量效关系。由此可以推断，肺纤方对BLM致大鼠肺纤维化的作用机制，可能与降低肺纤维化大鼠血清中TGF-β1、PDGF和TNF-α等细胞因子有关，抑制TGF-β1、PDGF和TNF-α可能是肺纤方抗肺纤维化的作用机制之一。

参考文献：

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[4] 焦婧，邢丽华.特发性肺纤维化的治疗进展[J].国际呼吸杂志，2010， 30（24）：1512.

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[9] 蔡后荣.特发性肺纤维化治疗药物临床研究中的困惑与反思[J].中华结核和呼吸杂志，2010，33（11）：869.

[10] 郑金旭，卢坤琴，夏德刚，等.柴胡皂甙d对博来霉素诱导肺纤维化小鼠的治疗作用及机制研究[J].中华医学杂志，2010，90（12）：808.

（收稿日期：2012-09-11，编辑：华强）